郝龍飛，小 紅，邵東華，劉婷巖，許吉康，張之月，于凡舒

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

土壤酶是生態(tài)系統(tǒng)中不可缺少的一類(lèi)蛋白質(zhì)化合物的總稱(chēng)，主要來(lái)自微生物和根系分泌以及植物殘?bào)w分解等[1]。土壤水解酶在土壤碳(C)、氮(N)、磷(P)養(yǎng)分循環(huán)過(guò)程中被廣泛研究，其中β-1，4葡萄糖苷酶(BG)、β-1，4-N-乙酰-氨基葡糖氨糖苷酶(NAG)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)、磷酸酶(AP)在土壤C、N、P轉(zhuǎn)化和遷移過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2-3]。土壤酶對(duì)外界環(huán)境變化過(guò)程較為敏感，進(jìn)而反映土壤微生物的活性[4]。全球變化是導(dǎo)致環(huán)境變化的主要因素之一，其中N沉降增加導(dǎo)致陸地生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生了一系列變化，如土壤酸化和微生物群落結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致土壤酶活性發(fā)生相應(yīng)變化，從而影響生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)[5]。研究表明，土壤酶化學(xué)計(jì)量比可反映微生物群落的新陳代謝及養(yǎng)分需求與環(huán)境中養(yǎng)分有效性之間的生物地球化學(xué)平衡，并用來(lái)評(píng)價(jià)微生物 C、N、P 養(yǎng)分資源需求[6]。馬偉偉等[7]對(duì)高山林地土壤酶活性的研究發(fā)現(xiàn)，高N質(zhì)量分?jǐn)?shù)抑制BG酶、NAG酶和AP酶活性。宰學(xué)明等[8]通過(guò)對(duì)菌根化濱梅(Prunusmaritima)苗的研究發(fā)現(xiàn)，菌根能增加根際土壤酶的活性，導(dǎo)致土壤有效養(yǎng)分生態(tài)化學(xué)計(jì)量比發(fā)生改變[9]?？偨Y(jié)以往研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)于根際土壤酶及其化學(xué)計(jì)量比對(duì)N添加和菌根效應(yīng)多為單一因素的響應(yīng)研究，二者交互作用的相關(guān)研究較為缺乏。

本研究以菌根依賴型樹(shù)種樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)苗木為材料，通過(guò)對(duì)比分析N添加對(duì)菌根苗和非菌根苗土壤胞外酶活性及其計(jì)量比、土壤理化性質(zhì)以及微生物養(yǎng)分限制的影響。擬揭示菌根苗與非菌根苗根際土壤胞外酶活性和化學(xué)計(jì)量特征對(duì)不同N添加水平的響應(yīng)差異，不同N添加水平下，菌根菌如何調(diào)控苗木根際土壤微生物養(yǎng)分限制，以期為全球氣候變化背景下探究生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年2月，將樟子松種子用2%的KMnO4溶液消毒30 min，然后用無(wú)菌水沖洗干凈；在25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中催芽，待種子萌發(fā)后播入裝有高溫高壓滅菌基質(zhì)(蛭石與土體積比為1∶2)的花盆中(D=15 cm)，并放入人工氣候室培育(溫度25 ℃，最大濕度60%，最大光照強(qiáng)度10 000 Lx)培養(yǎng)2月后待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 菌劑制備 選用樟子松優(yōu)勢(shì)菌根真菌：褐環(huán)粘蓋牛肝菌(Suillusluteus)、厚環(huán)粘蓋牛肝菌(Suillusgrevillei)、黃褐口蘑(Tricholomafulvum)、淺灰小牛肝菌(Boletinusgrisellus)、粘蓋牛肝菌(Suillusbovinus)、球根白絲膜菌(Leucocortinariusbulbiger)、淺黃根須腹菌(Rhizopogonluteolus)和彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)。上述8種菌劑均采用MMN培養(yǎng)液與蛭石配置成固體培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌1 h，待冷卻后分別接種外生菌根真菌，置于25 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)擴(kuò)繁，25 d長(zhǎng)滿菌袋后備用。

1.2.2 接菌處理 2019年4月，設(shè)置2種接菌處理，分別為混合接菌處理(以下簡(jiǎn)稱(chēng)+M)和未接菌處理(以下簡(jiǎn)稱(chēng)-M)。接菌方法為：在育苗盆底部放入適量滅菌基質(zhì)，然后取上述培養(yǎng)好的8種菌根真菌菌劑等質(zhì)量混勻后，平鋪于滅菌基質(zhì)上，同時(shí)選取培養(yǎng)2個(gè)月的長(zhǎng)勢(shì)良好的苗木栽入育苗盆中，盡量使苗木根系與菌劑充分接觸，每盆接菌量20.0 g，每盆栽植5株幼苗，每盆質(zhì)量控制1.0 kg；對(duì)照處理加入經(jīng)滅菌的20.0 g固體混合菌劑，同樣方法栽植苗木，澆透水，將不同處理的育苗盆隨機(jī)排布，置于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)苗圃(111°43′15.88″E，40°48′49.48″N)溫室大棚內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 模擬氮添加處理 2019年6月，測(cè)定+M處理苗木菌根侵染率達(dá)到了23.9%(-M處理苗木菌根侵染率為0%)，開(kāi)始模擬N添加試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)區(qū)N沉降背景值為34.3 kg·hm-2·a-1[10]，設(shè)置4個(gè)N梯度處理：不施氮(0N，0 kg·hm-2·a-1)、低氮(LN，15 kg·hm-2·a-1)、中氮(MN，30 kg·hm-2·a-1)、高氮(HN，60 kg·hm-2·a-1)。用自來(lái)水溶解的KNO3和NH4Cl(NO3-∶NH4+為1∶1)作為N添加溶液，隔10 d定量施入不同濃度的N溶液100 mL·盆-1，施N操作分10次施入。接菌處理包括混合接菌和未接菌，N添加包括4個(gè)N梯度，共計(jì)8種處理組合，每個(gè)處理組合設(shè)置75株苗木重復(fù)，共培育600株苗木。采用噴灑方法將N施入育苗盆中，模擬降雨方式將N帶入土壤中，同時(shí)施入也更為均勻。

1.3 土壤速效養(yǎng)分和胞外酶活性測(cè)定

2019年9月，N添加試驗(yàn)結(jié)束，間隔15 d后，測(cè)定N添加和接種處理下苗木單株生物量為0.21 g。各處理中分別取75株苗木的根際土壤，25株苗木的根際土混合1個(gè)土壤樣品，每個(gè)處理3次重復(fù)。

土壤堿解N采用堿解擴(kuò)散法；土壤有效P測(cè)定采用浸提-鉬銻抗比色法；土壤速效K含量用火焰光度法測(cè)定[11]。土壤胞外酶活性的測(cè)定包括土壤C相關(guān)酶[β-1，4 葡萄糖苷酶(BG)]、土壤N相關(guān)酶[亮氨酸氨基肽酶和β-1(LAP)和4-N-乙酰-氨基葡糖苷酶(NAG)]、土壤P相關(guān)酶[堿性磷酸酶(ALP)]，具體測(cè)定參考R.L.Sinsabaughetal[12]的方法，以對(duì)硝基苯酚的濃度表征土壤胞外酶活性[13]。

酶化學(xué)計(jì)量特征計(jì)算公式：

C∶NEEA=lnBG/ln(LAP+NAG)

(1)

C∶PEEA= lnBG/ln(ALP)

(2)

N∶PEEA= ln(LAP+NAG)/ln(ALP)

(3)

Vector L=SQRT((C∶NEEA)2+(C∶PEEA)2)

(4)

Vector A=DEGREES(ATAN2(C∶PEEA,C∶NEEA))

(5)

式中：C∶NEEA、C∶PEEA、N∶PEEA分別表示土壤酶化學(xué)計(jì)量C、N比；C、P比；N、P比。相對(duì)較長(zhǎng)的向量長(zhǎng)度(Vector L)表示更大微生物相對(duì)C限制；向量的角度(Vector A)<45°表示微生物相對(duì)N限制的程度；向量的角度>45°表示微生物相對(duì)P限制的程度[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 23.0(SPSS for windows,chicago,USA)對(duì)接菌和N添加處理進(jìn)行雙因素交互作用分析，并用LSD多重比較法檢驗(yàn)各處理間苗木根際土壤理化指標(biāo)、胞外酶活性及其生態(tài)化學(xué)計(jì)量特征的差異性。采用R語(yǔ)言4.0.2(R development core team2021)進(jìn)行偏最小二乘路徑模型(PLS-PM)路徑分析，采用Sigmaplot10.0(systat software inc.,san jose,USA)做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 接菌和N添加處理對(duì)樟子松苗木根際土壤速效養(yǎng)分的影響

接菌和N添加處理的交互作用顯著影響樟子松根際土壤中有效P和速效K。不同接菌處理下，隨N添加量增加根際土壤中堿解N均呈增加的趨勢(shì)，菌根苗根際土壤有效P和速效K分別在HN和LN處理下達(dá)到最大(表1)。2種接菌處理下，LN、MN、HN處理間堿解N無(wú)顯著差異，但均顯著高于0N處理。-M處理下，N添加處理間根際土有效P無(wú)顯著差異；而+M處理下，HN處理的有效P較0N、LN、MN處理分別顯著增加了44.7%、61.8%、57.1%。-M處理下，LN處理的根際土速效K較HN處理降低了12.8%(P<0.05)；而+M處理下，LN處理的速效K較HN處理增加了11.0%(P<0.05)(表1)。

表1 接菌和N添加處理對(duì)樟子松根際土壤速效養(yǎng)分的影響

2.2 接菌和N添加對(duì)樟子松苗木根際土壤胞外酶活性的影響

接菌和N添加處理的交互作用顯著影響LAP、NAG、ALP酶活性。-M處理下，隨著N質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加土壤中LAP酶活性呈下降的趨勢(shì)，而NAG和ALP酶活性均呈增加的趨勢(shì)；+M處理下，隨著N質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加土壤中LAP、NAG、ALP酶活性均呈先增加后下降的趨勢(shì)(表2)。LN、MN、HN處理下，+M處理的BG酶活性均顯著低于-M處理。LN、MN處理下，+M處理的LAP、NAG和ALP活性均顯著高于-M處理。HN處理下，+M處理的LAP酶活性較-M處理增加了60.8%(P<0.05)，而+M處理的NAG和ALP酶活性較-M處理分別降低了18.6%(P<0.05)和30.3%(P<0.05)(表2)。

表2 接菌和氮添加處理對(duì)樟子松根際土壤胞外酶活性的影響

2.3 接菌和N添加對(duì)樟子松苗木根際土壤酶化學(xué)計(jì)量特征的影響

接菌和N添加處理的交互作用顯著影響根際土壤酶化學(xué)計(jì)量特征。-M處理下，隨N質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，根際土壤中C∶NEEA、Vector A呈增加的趨勢(shì)，C∶PEEA和N∶PEEA呈下降的趨勢(shì)，Vector L呈先增加后下降的趨勢(shì)(表3)。+M處理下，隨N質(zhì)量濃度增加，C∶NEEA、C∶PEEA、Vector L呈下降的趨勢(shì)，而N∶PEEA和Vector A無(wú)顯著差異。0N處理下，+M處理的C∶PEEA和N∶PEEA較-M處理分別降低了14.7%(P<0.05)和18.5%(P<0.05)，而+M處理的Vector A較-M處理增加了12.4%(P<0.05)。LN、MN、HN處理下，+M處理的Vector L較-M處理分別降低了27.0%(P<0.05)、32.4%(P<0.05)和28.3%(P<0.05)。MN、HN處理下，+M處理的Vector A較-M處理分別降低了5.5%(P<0.05)和10.6%(P<0.05)。-M處理下，0N、LN、MN根際土壤C∶N∶PEEA均為1∶1∶1，HN轉(zhuǎn)變?yōu)?∶1∶2，而+M處理下，0N為1∶1∶1，LN、MN、HN轉(zhuǎn)變?yōu)?∶1∶2(表3)。

表3 接菌和氮添加處理對(duì)樟子松根際土壤酶化學(xué)計(jì)量特征的影響

2.4 微生物養(yǎng)分限制與土壤速效養(yǎng)分和胞外酶活性的關(guān)系

通過(guò)PLS-PM路徑分析N添加處理、接菌處理、土壤速效養(yǎng)分和胞外酶活性對(duì)微生物養(yǎng)分限制影響的擬合度為0.67(圖1A)。接菌處理(0.47)和N處理(0.44)對(duì)微生物養(yǎng)分限制的直接影響均為正效應(yīng)。接菌處理通過(guò)影響土壤速效養(yǎng)分和胞外酶活性，最終通過(guò)胞外酶活性正效應(yīng)作用于微生物養(yǎng)分限制。N添加處理通過(guò)影響土壤速效養(yǎng)分作用于土壤胞外酶活性，間接影響微生物養(yǎng)分限制。影響微生物養(yǎng)分限制的因子總效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，接菌處理調(diào)控微生養(yǎng)分限制的最重要的路徑，效應(yīng)系數(shù)順序?yàn)榻泳幚?N添加處理>土壤速效養(yǎng)分>土壤胞外酶活性(圖1B)。

注：PLS-PM分析接種菌根菌和N添加處理下生態(tài)化學(xué)計(jì)量特征對(duì)微生物養(yǎng)分限制影響的主要路徑(圖A和B)。實(shí)線和虛線箭頭表示正向和負(fù)向效應(yīng)關(guān)系。箭頭上的數(shù)字表示路徑系數(shù)(*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，NS表示不顯著)。

3 結(jié)論與討論

3.1 接菌處理調(diào)控樟子松根際土壤微生態(tài)環(huán)境對(duì)N添加的響應(yīng)

菌根共生體作為植物和土壤之間物質(zhì)循環(huán)的紐帶[15]，對(duì)調(diào)控根際微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性具有重要的作用[16]。不同接菌處理下，隨N添加增加樟子松根際土壤堿解N呈增加的趨勢(shì)，表明外源N輸入已改變根際土壤的N平衡。研究也發(fā)現(xiàn)接種菌根真菌提高了高N環(huán)境中根際土壤有效P和速效K含量，原因可能是接種菌根真菌與植物形成共生體，且菌絲網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)大了植物養(yǎng)分吸收范圍，進(jìn)而增強(qiáng)了植物根際微生物對(duì)高N添加的忍受能力[17]。土壤微生物與植物根系通過(guò)分泌根際土壤酶影響根際微生態(tài)環(huán)境中礦質(zhì)元素的轉(zhuǎn)化和分解[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著N質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加非菌根苗根際土壤中與N相關(guān)的酶活性呈下降的趨勢(shì)，與P相關(guān)的酶呈上升的趨勢(shì)，原因?yàn)橥庠催M(jìn)入土壤中減少土壤N相關(guān)水解酶的合成，N添加提高了植物對(duì)土壤P的吸收，導(dǎo)致土壤P相關(guān)水解酶增加。然而，N添加導(dǎo)致菌根苗根際土壤胞外酶活性均呈先增加后下降的趨勢(shì)，表明菌根真菌改變根際土壤酶的原有的響應(yīng)規(guī)律，原因可能為不同微生物生態(tài)策略存在差異，研究表明菌根真菌符合K生長(zhǎng)策略，相較于細(xì)菌r生長(zhǎng)策略，使生態(tài)系統(tǒng)相對(duì)穩(wěn)定[20]，因此接種菌根真菌提高了生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，一定范圍的N添加，+M處理的LAP、NAG和ALP活性均顯著高于-M處理(表2)，表明N添加對(duì)苗木菌根的影響存在閾值，因?yàn)榇罅縉輸入一定程度上破壞菌根共生關(guān)系[13]。

3.2 菌根菌和N添加處理對(duì)根際土壤微生物養(yǎng)分限制的影響

土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量學(xué)反映了微生物對(duì)C、N和P的養(yǎng)分需求，在全球尺度和中國(guó)南北樣帶上，C、N和P獲取酶的對(duì)數(shù)比趨近于1∶1∶1，表明土壤微生物營(yíng)養(yǎng)元素的化學(xué)計(jì)量穩(wěn)態(tài)[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，0N、LN、MN處理下非菌根苗根際土壤中C∶N∶PEEA均為1，表明微生物在低N輸入的背景下，微生物營(yíng)養(yǎng)元素獲取酶之間趨于穩(wěn)態(tài)，而HN添加打破了微生物養(yǎng)分平衡，以上結(jié)果也證明了根際微生態(tài)環(huán)境對(duì)N添加存在閾值范圍。研究也發(fā)現(xiàn)隨N質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，非菌根苗根際土壤微生物P限制增加。原因?yàn)榉蔷珉S外源N輸入，增加植物對(duì)土壤中P獲取，導(dǎo)致土壤中微生物P限制增強(qiáng)[23]。研究發(fā)現(xiàn)，LN、MN、HN處理下菌根苗土壤微生物的養(yǎng)分獲取酶生態(tài)計(jì)量關(guān)系同樣被破壞，然而菌根苗根際土微生物P限制并無(wú)顯著差異，一方面原因?yàn)榫婢纳屏宋⑸鷳B(tài)環(huán)境[24]，維持根際微生態(tài)環(huán)境的自穩(wěn)態(tài)[25]，另一方面原因?yàn)榫婢梢灾苯踊蜷g接影響微生物群落結(jié)構(gòu)組成[26]，其中土壤中磷酸鹽溶解細(xì)菌提高了磷酸鹽的溶解度[27]，進(jìn)而導(dǎo)致菌根苗根際土壤微生物P限制未發(fā)生明顯改變。研究也發(fā)現(xiàn)，隨N質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，非菌根苗根際土壤微生物C限制呈先增加后下降的趨勢(shì)，而菌根苗呈下降的趨勢(shì)。以上結(jié)果的原因可能是一定范圍的N添加減少細(xì)根數(shù)量，同時(shí)增加根系壽命[28]，導(dǎo)致土壤中C釋放減少，根際微生物間C競(jìng)爭(zhēng)增強(qiáng)，而高N輸入破壞原有生態(tài)平衡[29]，導(dǎo)致根際土壤微生物C限制降低。同時(shí)接菌處理促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)微生態(tài)環(huán)境對(duì)N添加的適應(yīng)能力[30]，因此，高N添加下接菌處理中土壤微生物C限制降低。通過(guò)路徑分析也發(fā)現(xiàn)，接菌處理對(duì)微生物養(yǎng)分限制為正效應(yīng)。因此，本研究發(fā)現(xiàn)菌根真菌有效調(diào)控了氮添加下根際微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性，降低苗木根際微生物的C和P限制。