何顯杰

清豐縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南清豐 457300

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛乳腺組織發(fā)生病理機能變化的防御應答反應[1]，大多數(shù)病例由病原微生物侵染奶牛機體內部而引發(fā)，對奶牛泌乳性能、乳汁理化特性和生理繁殖機能等造成不利影響，成為奶牛疾病防控的重要內容。致病性細菌是奶牛乳房炎的主要致病因子，種類較多，盡管奶牛乳房炎致病菌存在區(qū)域差別，但金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，約占細菌性乳房炎的70%以上[2]。在長期獸醫(yī)臨床治療中，抗生素在防控細菌性奶牛乳房炎方面發(fā)揮了重要作用，但也帶來了牛奶抗生素殘留超標、耐藥菌株不斷增多等嚴重問題。

中草藥來源廣泛，存在于動植物和礦石等中，具有無毒或低毒、無污染、無殘留和無耐藥性等諸多優(yōu)勢[3]。很多中草藥表現(xiàn)抗毒素和抑菌的藥物功效，能夠提高動物免疫力和機體的抗病能力，是很好的抗生素替代品。本試驗根據(jù)中獸藥理論，結合乳房炎致病機制，按照“清熱解毒、抗菌消炎、消腫止疼和通經(jīng)利乳”的配伍原則，選取10 種中草藥應用于奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌的體外抑菌試驗，旨在篩選抑菌效果顯著的中草藥，為臨床防治奶牛乳房炎的中草藥研制和應用提供技術支持。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 中草藥

板藍根、蒲公英、紫花地丁、黃連、連翹、黃芩、金銀花、魚腥草、紅花和大青葉，購自濮陽市天業(yè)藥店。分別稱取上述中草藥20 g，用去離子水浸泡2～3 h，猛火煮開后調為文火，煮30 min，過濾，藥渣中再加去離子水，煮20 min，過濾。2 次藥液合并濃縮至藥液濃度為1 g/mL，分裝于玻璃瓶，4 ℃保存，備用。

1.1.2 菌株和培養(yǎng)基

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌來自清豐縣部分奶牛場乳房炎奶牛，經(jīng)分離鑒定得到。普通肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（含2%小牛血清）由濮陽市動物疫病控制中心提供。

用接種環(huán)無菌挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于普通肉湯培養(yǎng)基，無乳鏈球菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（含2%小牛血清），37 ℃培養(yǎng)18～24 h，3 種菌液復壯后，在紫外可見光光度計下比色，將波長調至625 nm處進行稀釋菌液，當吸光度值為0.08～0.1時細菌濃度為1×108～2×108CFU/L即可，備用。

1.1.3 試驗儀器

無菌操作臺、高壓滅菌鍋、紫外可見分光光度計UV5，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；恒溫箱、打孔器（孔徑Φ＝3 mm）等，本實驗室提供。

1.2 抑菌試驗

根據(jù)參考文獻[4]，采用試管二倍稀釋法測定中草藥對3 種細菌的最低抑菌濃度（MIC）。體外抑菌試驗：取30 支5 mL滅菌試管，分成3組（1 種菌液1組），每組10 支試管，分別標記1～10號，每組每個試管中裝入1 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，另在每組1號試管添加1 mL中草藥液，搖勻，吸取1 mL混合液加入2號試管，以此類推，至8號試管（棄去1 mL），9號試管設為菌液空白對照，不添加中草藥液，10號試管設為中草藥液對照，不添加菌液。分別吸取0.05 mL制備后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌加入每組每個試管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，與空白對照比較，以肉眼觀察培養(yǎng)基清亮且未見細菌生長的最低濃度判定為該藥物的最低抑菌濃度（MIC）。每組3 個重復，取重復數(shù)值多者為MIC值。

2 試驗結果

2.1 中草藥對金黃色葡萄球菌的抑菌試驗結果

連翹對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC為15.63 mg/mL，其次為板藍根、蒲公英、紫花地丁、黃芩、金銀花、大青葉，MIC均為31.25 mg/mL（表1）。

表1 中草藥對金黃色葡萄球菌抑菌試驗結果

2.2 中草藥對大腸桿菌抑菌試驗結果

板藍根、蒲公英和黃芩的MIC最低，為62.5 mg/mL，抑菌效果最好，其次為紫花丁、連翹、金銀花和魚腥草，MIC為125 mg/mL（表2）。

表2 中草藥對大腸桿菌抑菌試驗結果

2.3 中草藥對無乳鏈球菌的抑菌試驗結果

紫花丁的MIC最低為15.63 mg/mL，抑菌效果最好，其次為板藍根、蒲公英、紫花丁、連翹、黃芩和金銀花，MIC為31.25 mg/mL（表3）。

表3 中草藥對無乳鏈球菌的抑菌試驗結果

3 討論

細菌是引起奶牛乳房炎的主要病原微生物，因此，殺滅或者抑制細菌生長繁殖是防治該病的關鍵。在我國實行飼料禁抗的大趨勢下，中草藥含有許多天然生物活性成分，抗菌消炎效果較好，是抗生素替代品的主要研究方向。謝成運等[5]應用黃芩、黃連、丹參、連翹等對奶牛乳房炎主要致病菌體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)中草藥對金黃色葡萄球菌抑菌效果較好。百合地開力地等[6]報道，金銀花、魚腥草、紅花等對奶牛乳房炎主要致病菌（大腸桿菌、鏈球菌和綠膿桿菌等）的最小抑菌濃度均為15.63 mg/mL；丁月云等[7]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩、大青葉、連翹等對豬大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著。朱曉萍等[8]研究黃連等中草藥對常見病原菌的體外抑菌效果，結果顯示，所選10 種中草藥對奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌均有不同程度的抑菌效果。本試驗結果顯示，連翹對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC為15.63 mg/mL；板藍根、蒲公英和黃芩對大腸桿菌抑菌效果最好，MIC為62.5 mg/mL；紫花丁對無乳鏈球菌抑菌效果最好，MIC為15.63 mg/mL。與上述學者研究結果相同或近似。但是，體外抑菌試驗對中草藥的抗菌作用只能是一種參考性的方法，其實際臨床應用效果還必須通過動物體內試驗加以比較、驗證，從而進一步闡明其抑菌機理。

4 結論

本試驗10 種中草藥對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌均具有不同程度的抑菌特性。該試驗結果對臨床應用中藥防治奶牛乳房炎病具有一定的積極意義，為進一步篩選效果良好的抗菌中藥復方提供參考。