何顯杰
清豐縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,河南清豐 457300
奶牛乳房炎是奶牛乳腺組織發(fā)生病理機能變化的防御應答反應[1],大多數(shù)病例由病原微生物侵染奶牛機體內部而引發(fā),對奶牛泌乳性能、乳汁理化特性和生理繁殖機能等造成不利影響,成為奶牛疾病防控的重要內容。致病性細菌是奶牛乳房炎的主要致病因子,種類較多,盡管奶牛乳房炎致病菌存在區(qū)域差別,但金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌,約占細菌性乳房炎的70%以上[2]。在長期獸醫(yī)臨床治療中,抗生素在防控細菌性奶牛乳房炎方面發(fā)揮了重要作用,但也帶來了牛奶抗生素殘留超標、耐藥菌株不斷增多等嚴重問題。
中草藥來源廣泛,存在于動植物和礦石等中,具有無毒或低毒、無污染、無殘留和無耐藥性等諸多優(yōu)勢[3]。很多中草藥表現(xiàn)抗毒素和抑菌的藥物功效,能夠提高動物免疫力和機體的抗病能力,是很好的抗生素替代品。本試驗根據(jù)中獸藥理論,結合乳房炎致病機制,按照“清熱解毒、抗菌消炎、消腫止疼和通經(jīng)利乳”的配伍原則,選取10 種中草藥應用于奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌和大腸桿菌的體外抑菌試驗,旨在篩選抑菌效果顯著的中草藥,為臨床防治奶牛乳房炎的中草藥研制和應用提供技術支持。
1.1.1 中草藥
板藍根、蒲公英、紫花地丁、黃連、連翹、黃芩、金銀花、魚腥草、紅花和大青葉,購自濮陽市天業(yè)藥店。分別稱取上述中草藥20 g,用去離子水浸泡2~3 h,猛火煮開后調為文火,煮30 min,過濾,藥渣中再加去離子水,煮20 min,過濾。2 次藥液合并濃縮至藥液濃度為1 g/mL,分裝于玻璃瓶,4 ℃保存,備用。
1.1.2 菌株和培養(yǎng)基
金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌來自清豐縣部分奶牛場乳房炎奶牛,經(jīng)分離鑒定得到。普通肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(含2%小牛血清)由濮陽市動物疫病控制中心提供。
用接種環(huán)無菌挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于普通肉湯培養(yǎng)基,無乳鏈球菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(含2%小牛血清),37 ℃培養(yǎng)18~24 h,3 種菌液復壯后,在紫外可見光光度計下比色,將波長調至625 nm處進行稀釋菌液,當吸光度值為0.08~0.1時細菌濃度為1×108~2×108CFU/L即可,備用。
1.1.3 試驗儀器
無菌操作臺、高壓滅菌鍋、紫外可見分光光度計UV5,梅特勒托利多科技(中國)有限公司;恒溫箱、打孔器(孔徑Φ=3 mm)等,本實驗室提供。
根據(jù)參考文獻[4],采用試管二倍稀釋法測定中草藥對3 種細菌的最低抑菌濃度(MIC)。體外抑菌試驗:取30 支5 mL滅菌試管,分成3組(1 種菌液1組),每組10 支試管,分別標記1~10號,每組每個試管中裝入1 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,另在每組1號試管添加1 mL中草藥液,搖勻,吸取1 mL混合液加入2號試管,以此類推,至8號試管(棄去1 mL),9號試管設為菌液空白對照,不添加中草藥液,10號試管設為中草藥液對照,不添加菌液。分別吸取0.05 mL制備后的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌加入每組每個試管中,37 ℃培養(yǎng)24 h,與空白對照比較,以肉眼觀察培養(yǎng)基清亮且未見細菌生長的最低濃度判定為該藥物的最低抑菌濃度(MIC)。每組3 個重復,取重復數(shù)值多者為MIC值。
連翹對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好,MIC為15.63 mg/mL,其次為板藍根、蒲公英、紫花地丁、黃芩、金銀花、大青葉,MIC均為31.25 mg/mL(表1)。
表1 中草藥對金黃色葡萄球菌抑菌試驗結果
板藍根、蒲公英和黃芩的MIC最低,為62.5 mg/mL,抑菌效果最好,其次為紫花丁、連翹、金銀花和魚腥草,MIC為125 mg/mL(表2)。
表2 中草藥對大腸桿菌抑菌試驗結果
紫花丁的MIC最低為15.63 mg/mL,抑菌效果最好,其次為板藍根、蒲公英、紫花丁、連翹、黃芩和金銀花,MIC為31.25 mg/mL(表3)。
表3 中草藥對無乳鏈球菌的抑菌試驗結果
細菌是引起奶牛乳房炎的主要病原微生物,因此,殺滅或者抑制細菌生長繁殖是防治該病的關鍵。在我國實行飼料禁抗的大趨勢下,中草藥含有許多天然生物活性成分,抗菌消炎效果較好,是抗生素替代品的主要研究方向。謝成運等[5]應用黃芩、黃連、丹參、連翹等對奶牛乳房炎主要致病菌體外抑菌試驗,發(fā)現(xiàn)中草藥對金黃色葡萄球菌抑菌效果較好。百合地開力地等[6]報道,金銀花、魚腥草、紅花等對奶牛乳房炎主要致病菌(大腸桿菌、鏈球菌和綠膿桿菌等)的最小抑菌濃度均為15.63 mg/mL;丁月云等[7]研究發(fā)現(xiàn),黃芩、大青葉、連翹等對豬大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌效果顯著。朱曉萍等[8]研究黃連等中草藥對常見病原菌的體外抑菌效果,結果顯示,所選10 種中草藥對奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌均有不同程度的抑菌效果。本試驗結果顯示,連翹對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好,MIC為15.63 mg/mL;板藍根、蒲公英和黃芩對大腸桿菌抑菌效果最好,MIC為62.5 mg/mL;紫花丁對無乳鏈球菌抑菌效果最好,MIC為15.63 mg/mL。與上述學者研究結果相同或近似。但是,體外抑菌試驗對中草藥的抗菌作用只能是一種參考性的方法,其實際臨床應用效果還必須通過動物體內試驗加以比較、驗證,從而進一步闡明其抑菌機理。
本試驗10 種中草藥對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和無乳鏈球菌均具有不同程度的抑菌特性。該試驗結果對臨床應用中藥防治奶牛乳房炎病具有一定的積極意義,為進一步篩選效果良好的抗菌中藥復方提供參考。