李子清，黃金明，沈立榮，石放雄＊

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇南京 210095

2 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100

3 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058

0 引言

人工授精（Artificial insemination，AI）作為一種常見的動物繁殖技術(shù)，授精效果很大程度上取決于精液質(zhì)量。常見精液的保存方法包括常溫（15～ 25 ℃）、低溫（0～5 ℃）和冷凍保存（-196 ℃）三種[1]。精液常溫保存和低溫保存方法主要應(yīng)用于畜禽場短時間的精液自產(chǎn)自用，冷凍保存方法能夠讓精液長久保存乃至運(yùn)輸，但對設(shè)備和操作技術(shù)要求較高，凍存后的精液品質(zhì)也參差不齊。此外，因精子中不飽和脂肪酸和卵磷脂含量較高，極易在冷凍過程中發(fā)生脂質(zhì)過氧化，一定程度上降低精子的抗氧化能力[2]。以往精液凍存液會添加甘油、乙二醇等作為保護(hù)劑，但這類保護(hù)劑在冷凍-凍融過程中會促進(jìn)自由基的產(chǎn)生，致使精子活力和受精能力降低，加劇DNA損傷[3]，影響凍存精液品質(zhì)。

蜂王漿（Royal jelly，RJ）是蜜蜂中青年工蜂頭部上顎腺和咽下腺共同分泌的一種淡黃色漿狀物質(zhì)，具有抗菌、抗炎癥、抗腫瘤及抗氧化等功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健和科研等領(lǐng)域中[4]。RJ在動物生殖上也表現(xiàn)出積極作用，Husein和Kridli[5]對母羊分別進(jìn)行飼喂和肌內(nèi)注射RJ，發(fā)現(xiàn)母羊產(chǎn)仔數(shù)、多肽率和妊娠率顯著提高。Ahmed等[6]在鎘構(gòu)建的大鼠睪丸損傷模型中發(fā)現(xiàn)，RJ對鎘誘導(dǎo)的睪丸組織損傷有保護(hù)作用。此外，Rahnm等[7]對雞進(jìn)行口服添加RJ，發(fā)現(xiàn)當(dāng)RJ添加量在100 mg/kg·BW時能夠提高精子冷凍-凍融后的活力和質(zhì)膜完整性。Amini等[8]發(fā)現(xiàn)，在山羊精液凍存液添加3% RJ能夠顯著提高精子存活率和質(zhì)膜完整性，并且降低精子畸形率，而添加5%RJ能抑制精子活力和增加精子畸形率。Alcay等[9]的研究結(jié)果也呈現(xiàn)出相似結(jié)果，向精液凍存液中分別添加0.25%、0.5%和0.75% RJ，其中添加0.5%和0.75%RJ，均能提高精子活力和降低精子質(zhì)膜完整性，并且各組間DNA損傷無顯著性差異。Shahzad等[10]在水牛精液凍存液中添加0.05%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4% RJ的試驗發(fā)現(xiàn)，添加0.1% RJ能夠顯著提高精子冷凍-凍融后的活力。RJ的主要成分包括水（60% ～70%）、蛋白質(zhì)（9% ～ 8%）、脂類（3% ～ 8%）、礦物質(zhì)、維生素以及少量未知成分，蜂王漿主蛋白（Major Royal Jelly Proteins，MRJPs）作為RJ主要活性物質(zhì)，占總蛋白含量的90%。先前的研究表明，MRJPs能夠屏蔽昆蟲和哺乳動物的細(xì)胞膜，使DNA、RNA免受氧化損傷，且MRJPs因其金屬螯合特性而表現(xiàn)出強(qiáng)清除自由基能力[11]。然而，有關(guān)直接將MRJPs應(yīng)用于精液凍存液的研究尚未見報道。因此本試驗開展了向公牛精液凍存液中添加不同濃度的MRJPs探索，以期利用MRJPs的生物學(xué)功能，在現(xiàn)有凍存精液品質(zhì)基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高凍存精液的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蜂王漿主蛋白凍干粉，浙江大學(xué)沈立榮教授團(tuán)隊提供；荷斯坦公牛精液、精液凍存液，山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司；細(xì)管灌裝機(jī)，上?？ㄌK生物科技有限公司；0.25 mL精液細(xì)管，上?？ㄌK生物科技有限公司；DMSO-細(xì)胞培養(yǎng)級，北京索萊寶科技有限公司；恒溫精子分析儀，美國漢密爾頓有限公司。

1.2 方法

設(shè)置1 個對照組和4 個處理組，處理組精液凍存液中依次按照0 g/25 mL、0.01 g/25 mL、0.02 g/25 mL、0.03 g/25 mL、0.04 g/25 mL的濃度添加MRJPs，再分別添加5% DMSO，促進(jìn)凍干MRJPs溶解。選擇精子密度≥1.0×108個/mL，活力≥95%的精液，將精液稀釋至5.0×107個/mL后，依次等量添加到各組凍存液中。按照商品精液生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化流程完成精液的冷凍保存，并在凍存48 h后利用恒溫精子分析儀完成各組精子相關(guān)參數(shù)測定（9 個視野數(shù)值×3 個重復(fù)×5 支精細(xì)管，單次重復(fù)精液用量20 μL）。最終數(shù)據(jù)結(jié)果采用One-Way-ANOVA分析，結(jié)合Duncan（假定方差齊性）和Dunnett's（偽假定方差齊性）進(jìn)行多重比較， 顯著性差異用標(biāo)記字母法表示。

2 結(jié)果與分析

公牛精液凍存液中添加不同濃度的MRJPs對凍存精子總活力、精子直行性活力、快速前進(jìn)性活力、緩慢前進(jìn)性活力、畸形率和原地運(yùn)動精子比率的影響結(jié)果如圖1所示。凍存48 h后結(jié)果顯示，MRJPs濃度0.04 g/25 mL組精子總活力顯著低于對照組（P＜0.05），而MRJPs濃度0.01 g/25 mL、0.02 g/25 mL、0.03 g/25 mL 三組精子總活力與對照組無顯著性差異（P＞0.05）。MRJPs濃度0.04 g/25 mL組精子快速前進(jìn)性活力顯著低于對照組（P＜0.05），而0.01 g/25 mL組快速前進(jìn)性活力無顯著性差異（P＞ 0.05）。0.04 g/25 mL組精子緩慢前進(jìn)性活力顯著低于對照組（P＜0.05）。MRJPs濃度0.04g/25 mL組精子前進(jìn)性活力顯著低于對照組和其余處理組（P＜0.05），MRJPs濃度0.01 g/25 mL組前進(jìn)性活力與對照組相比無顯著性差異（P＞0.05），MRJPs濃度0.02 g/25 mL、0.03 g/25 mL、0.04 g/25 mL三組前進(jìn)性活力顯著低于對照組（P＜0.05）。精子畸形率和原地運(yùn)動精子率各處理組與對照組相比無顯著性差異（P＞ 0.05）。

圖1 凍存液添加MRJPs對種公牛精液凍存48 h精子參數(shù)的影響

3 討論

本研究結(jié)果表明，精液凍存液中添加MRJPs會抑制精子活力，即除MRJPs濃度0.01 g/25 mL組與對照組精子活力無顯著性差異外，其余各組（0.02 g/25 mL、0.03 g/ 25 mL、0.04 g/ 25 mL）精子活力均呈出隨著MRJPs濃度的增加而呈抑制作用增強(qiáng)的趨勢，這與之前報道中添加RJ可提高凍存精子活力的結(jié)果相反。在之前添加RJ提高凍存精液試驗中，RJ添加濃度過高時，凍存后精子活力、畸形率和死亡率都會顯著性升高[8，9]。Yang等[12]的研究中也表明，高劑量RJ會影響精子形態(tài)以及造成睪丸組織病理學(xué)異常。Rahnm等[7]指出，過量添加RJ相當(dāng)于引入過量外源性抗氧化劑，打破了精液中原有氧化還原平衡，是精子質(zhì)量下降的主要原因。同時，高慧等[13]研究發(fā)現(xiàn)，RJ凍干樣良好的自由基清除能力以及抗氧化能力與RJ水溶性蛋白的含量呈正相關(guān)。RJ水溶性蛋白酶解后抗氧化能力得到增強(qiáng)[14]。從側(cè)面印證MRJPs的抗氧化能力可能是造成凍存后精子活力受抑制的主要原因。

MRJPs是一個功能多元化的蛋白家族，包含MRJP1～9等九個成員，除決定蜜蜂的級型分化和調(diào)節(jié)蜂王的生理功能外[15]，也被報道具有類雌激素效應(yīng)并促進(jìn)小鼠雌激素分泌，加快卵泡發(fā)育和小鼠成熟進(jìn)程的作用[16]。MRJPs中MRJP 1～5含量最豐富，MRJP-1以單體和寡聚體形式存在，其中寡聚體的形式多元化造就了MRJP-1生物活性的多樣化[17]，能夠促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的自我更新以及幼稚多功能性基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的出現(xiàn)[18]。MRJP-2在中華蜜蜂（Apis.cerana cerana）中屏蔽細(xì)胞膜，并通過降低半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。同時，MRJP-1和MRJP-2也都作為王漿蛋白中的主要抗菌物質(zhì)而存在[20]。MRJP-3則作為免疫調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)IL-4、IL-2的生成，進(jìn)而影響T細(xì)胞功能[21]。綜上，MRJPs擁有廣泛的生物學(xué)功能，且影響因子眾多，也使得在對凍存精液品質(zhì)的影響上觀點(diǎn)不一。在被報道RJ提高凍存精液品質(zhì)的相關(guān)試驗中，除MRJPs作為主要影響因子外，不排除RJ其余成分的作用。Tamura等[22]推測在凍存液中添加RJ（0.1%）可提高精子凍存后活力，可能與RJ成分中的氨基酸（天冬氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、賴氨酸等）有關(guān)，其中半胱氨酸可作為有效的抗氧化劑，在冷凍過程中起清除ROS的作用。此外，作為RJ特有的脂肪酸10-羥基-Δ2-癸烯酸（10-hydroxy-Δ2-dece-noicacid，10-HDA）具有抗菌、抗炎和抗衰老等強(qiáng)活性[23]，可能也具備提高凍存精子活力的作用。本研究表明，MRJPs添加到牛精液凍存液中會降低凍存精子活力，可能因為MRJPs的添加，致使精液中原有氧化還原平衡被破壞。今后將對RJ的不同成分、不同助溶劑、從RJ直接提取和透析得到的MRJPs與凍干粉進(jìn)一步進(jìn)行比較篩選，探索RJ中具有精子冷凍保存作用的成分、使用方式及作用機(jī)理。

4 結(jié)論

本文以提高凍存精液品質(zhì)為目標(biāo)，向牛精液凍存液中添加不同濃度MRJPs，評估凍存48 h后精子有關(guān)活力參數(shù)。在本試驗條件下，凍存液添加MRJPs不能提高凍存后精子活力，反而出現(xiàn)抑制作用，并提出了進(jìn)一步研究探索的方向。