秦山梅 沈沖 湯武裝 林穎 王昭君 張治中 劉新峰

卒中已成為我國居民死亡的第3位病因[1]。70%以上的卒中是缺血性卒中，其中以大動脈粥樣硬化型(large artery atherosclerosis，LAA)最常見，且該型更易受遺傳因素的影響[2]。有研究證實，基因多態(tài)性與LAA缺血性卒中密切相關[3]。

微RNA(micro-ribonucleic acid，miRNA)可通過部分抑制信使RNA或降解靶向的信使RNA，使靶基因轉(zhuǎn)錄后發(fā)生基因沉默[4]。在缺血性卒中發(fā)生發(fā)展的過程中，存在大量特異性miRNA差異性表達， miRNA可能成為缺血性卒中診斷及對高危人群評估的生物學標志物。研究顯示，miRNA-495及miRNA-200b參與了動脈粥樣硬化、血小板聚集與活化、新生血管形成等病理生理過程[5-8]。miRNA-495及miRNA-200b的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)會導致相應的miRNA及其靶基因失調(diào)，進而影響缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展[9]。目前，對于miRNA-495及miRNA-200b的SNPs與缺血性卒中發(fā)病年齡的相關性尚未明確，因此，本研究擬對miRNA-495及miRNA-200b的基因多態(tài)性與LAA缺血性卒中發(fā)病年齡的關聯(lián)進行探討，以期為缺血性卒中高危人群的病因預防及早期篩查提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象

連續(xù)回顧性納入2009年5月至2017年12月江蘇省宜興市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科LAA缺血性卒中住院患者697例，其中男429例，女268例；年齡39～82歲，平均(66.0±9.8)歲。本研究方案經(jīng)東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會批準(倫理號：2017NZGKJ-041)，患者或其家屬簽署了診療知情同意書。

納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)首次缺血性卒中，根據(jù)急性卒中Org 10172治療試驗(trial of Org10172 in acute stroke treatment，TOAST)分型診斷為LAA型[10]，并經(jīng)影像學證實。排除標準：(1)既往卒中、短暫性腦缺血發(fā)作史；(2)病歷資料不完整；(3)合并有其他系統(tǒng)嚴重疾病。

1.2 研究方法

記錄患者的基線資料，包括人口學特征(年齡、性別)、心腦血管疾病危險因素(高血壓病、高脂血癥、糖尿病)、不良嗜好(吸煙、飲酒史)。高血壓病、高脂血癥、糖尿病的評價分別參照國內(nèi)相關指南的標準[11-13]。吸煙史及飲酒史通過查閱病歷資料獲得。

1.3 易感基因多態(tài)性檢測及基因分型

通過NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫及既往文獻[9，14]，篩選出與LAA相關的2個基因(miRNA-495及miRNA-200b)中的2個SNPs位點，分別為rs2281611及rs7549819。

入院后次日清晨采集所有患者的空腹外周靜脈血5 ml，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，離心后取下層紅細胞，-80 ℃冰箱保存。由上海天昊生物科技有限公司采用SNPscan法對rs2281611、rs7549819進行基因分型。為評價基因分型的可靠性，隨機挑選部分樣本進行重復驗證，檢測結(jié)果符合率為100.0%。

依據(jù)rs2281611、rs7549819多態(tài)性基因分型，累計突變等位基因的個數(shù)，即患者基因型中所含2個SNPs突變等位基因(miRNA-200b C及miRNA-495 G)的個數(shù)之和。根據(jù)基因型中突變等位基因個數(shù)和，將患者分為3組，突變等位基因總數(shù)分別為0個(不攜帶突變等位基因)、1～2個、3～4個。

為了避免不同年齡段可能對結(jié)果帶來的影響，本研究先對年齡進行了分層分析，miRNA-200b rs7549819在59歲患者中不同基因型交叉最多(Log-rankχ2=5.546，P=0.019；圖1)，并結(jié)合世界衛(wèi)生組織的年齡劃分標準[15]，故本研究將LAA缺血性卒中患者分為中青年(年齡<59歲)、老年(年齡≥59歲)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 基線資料比較

697例LAA缺血性卒中患者中，無高血壓病史者平均發(fā)病年齡低于高血壓病史者，有吸煙史及飲酒史患者平均發(fā)病年齡低于無吸煙史及飲酒史者，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；其余基線資料平均發(fā)病年齡的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表1。

2.2 miRNA-495 rs2281611和miRNA-200b rs7549819多態(tài)性與LAA缺血性卒中發(fā)病年齡的關聯(lián)

在miRNA-495 rs2281611的共顯性模型中，TT、TG、GG型患者平均發(fā)病年齡的差異有統(tǒng)計學意義(F=4.224，P=0.015)，與TT型和TG型患者相比，GG型患者平均發(fā)病年齡更早，兩兩比較的差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.036、0.004)，TT型和TG型平均發(fā)病年齡的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.639)；在其隱性模型中，GG型患者平均發(fā)病年齡早于TT+TG型(P=0.004)；在其顯性模型中，TT型與TG+GG型平均發(fā)病年齡的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miRNA-200b rs7549819各遺傳模型中患者平均發(fā)病年齡的差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。在共顯性和隱性模型中，攜帶miRNA-495 rs2281611 GG型患者發(fā)生LAA缺血性卒中的發(fā)病風險更高(共顯性：HR=1.40，95%CI：1.12～1.74，P=0.003；隱性：HR=1.35，95%CI：1.13～1.62，P=0.001)。見表2。對miRNA-200b rs7549819隱性模型分析顯示，在年齡≥59歲的老年患者中，與TT+TC型相比，CC型LAA缺血性卒中發(fā)病風險增加了38.0%(HR=1.38，95%CI：1.08～1.77，P=0.009)，且CC型患者發(fā)病年齡會更早(Log-rankχ2=9.579，P=0.002)；中青年患者中CC型攜帶者LAA缺血性卒中發(fā)病風險則呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(HR=0.73，95%CI：0.45～1.18，P=0.193)，且與CC型患者發(fā)病年齡的差異無統(tǒng)計學意義(Log-rankχ2=1.651，P=0.199)。見圖2。

表2 miRNA-495 rs2281611和miRNA-200b rs7549819多態(tài)性與697例大動脈粥樣硬化型缺血性卒中發(fā)病年齡的關聯(lián)分析

rs7549819 T>C基因型例數(shù)[例(%)]發(fā)病年齡(x-±s,歲)檢驗值P值HR值e95% CIP值共顯性0.712c0.4910.161 TT282(40.5)66.0±10.01.00-- TC318(45.6)66.3±10.00.950.81～1.120.570 CC097(13.9)64.9±08.81.190.95～1.510.136顯性0.085d0.932 TT282(25.3)66.0±10.01.00-- TC+CC415(74.7)66.0±09.71.000.86～1.170.982隱性1.152d0.250 TT+TC600(77.0)66.2±10.01.00-- CC097(23.0)64.9±08.8 1.230.99～1.520.068

2.3 miRNA-495 rs2281611和miRNA-200b rs7549819突變等位基因數(shù)量與LAA缺血性卒中發(fā)病年齡的關聯(lián)

697例患者總體情況顯示，隨著攜帶累計突變等位基因數(shù)量的增加，LAA缺血性卒中患者平均發(fā)病年齡呈下降趨勢，攜帶0、1～2、3～4個累計突變等位基因LAA缺血性卒中患者發(fā)病年齡的差異有統(tǒng)計學意義(F=4.108，P=0.017)；與攜帶3～4個突變等位基因患者比較，攜帶0、1～2個突變等位基因LAA缺血性卒中患者發(fā)病年齡的差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.016、0.012)，攜帶0個與1～2個突變等位基因患者發(fā)病年齡的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.331)。與不攜帶突變等位基因患者相比，攜帶3～4個累計突變等位基因患者LAA缺血性卒中發(fā)病風險增加了41.0%(P=0.029)。對不同性別、年齡段LAA缺血性卒中患者發(fā)病年齡進行分析顯示，攜帶3～4個累計突變等位基因的女性及老年患者LAA缺血性卒中發(fā)病風險顯著增加(均P<0.05)，但該結(jié)果在男性及中青年患者中差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表3。

3 討論

本研究探討了miRNA-495 rs2281611、miRNA-200b rs7549819多態(tài)性與LAA缺血性卒中發(fā)病年齡之間的關聯(lián)，結(jié)果顯示，攜帶miRNA-495 rs2281611 GG型患者的LAA缺血性卒中發(fā)病年齡更早，而miRNA-200b rs7549819 CC型與老年患者LAA缺血性卒中發(fā)病年齡提前相關，同時，這2個SNPs突變等位基因累計個數(shù)是影響LAA缺血性卒中發(fā)病年齡的獨立危險因素，攜帶3～4個突變等位基因患者的LAA缺血性卒中發(fā)病風險顯著增加，該結(jié)果在女性及老年患者中更顯著。

大部分LAA缺血性卒中是由動脈粥樣硬化斑塊破裂及繼發(fā)血栓形成所致，使腦血流灌注不足，從而引起相應缺血區(qū)的腦組織功能障礙。既往研究表明，miRNA-200b、miRNA-495在上述病理生理過程中參與了調(diào)控[6，16]。缺氧時，miRNA-200b可抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達，限制一氧化氮的生物利用度，內(nèi)皮細胞代謝紊亂引起其功能障礙[5]。miRNA-200b表達水平升高會導致三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1水平下調(diào)，加速了動脈血管壁細胞脂質(zhì)積累，并抑制膽固醇逆轉(zhuǎn)運，促進泡沫細胞形成，從而加速動脈粥樣硬化的進展[16]。miRNA-495可抑制趨化因子配體2的表達，影響內(nèi)皮細胞增殖和遷移通路，參與動脈粥樣硬化的進程[17]。在血管再狹窄模型中，誘導miRNA-495表達沉默可抑制內(nèi)膜增生，減少動脈血管壁細胞中巨噬細胞的數(shù)量，從而抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，并增加斑塊的穩(wěn)定性[6]。

血小板與動脈粥樣硬化斑塊破裂后繼發(fā)的血栓形成密切相關[18]。miRNA-200b和miRNA-495可通過分別靶向蛋白激酶環(huán)磷酸腺苷依賴性Ⅱ型調(diào)節(jié)亞基β和Kelch樣蛋白5，從而干擾血小板的激活和聚集[7]。與靜息血小板相比，miRNA-495在受凝血酶刺激的血小板中表達水平上調(diào)[19]。miRNA-200b和miRNA-495失調(diào)會導致血小板表達水平及其反應性的改變，繼而影響血栓形成的過程。

rs2281611、rs7549819的位點均位于基因啟動子區(qū)，其發(fā)生突變能夠直接影響miRNA-495和miRNA-200b基因的轉(zhuǎn)錄，并干擾突變位點相關轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合過程，基于上述miRNA-495和miRNA-200b在動脈粥樣硬化進展[5-6，15-16]和繼發(fā)血栓形成[7，18]等方面重要的調(diào)控作用，rs2281611、rs7549819位點突變可能會通過干擾相應miRNA及其靶基因的合成或調(diào)節(jié)過程，從而影響缺血性卒中的發(fā)生發(fā)展[9]。既往研究表明，老年人群大動脈粥樣硬化負擔隨著年齡的增加而加重[20]，而青年缺血性卒中的主要危險因素為吸煙、飲酒、腰臀比和心理社會因素等[21]，且絕經(jīng)后女性表現(xiàn)出更高的動脈粥樣硬化斑塊破裂的風險[22]。本研究結(jié)果與文獻報道一致，提示rs2281611、rs7549819的多態(tài)性可能具有早期識別LAA缺血性卒中高風險人群的潛能。但rs2281611、rs7549819與LAA缺血性卒中患者發(fā)病年齡關系的具體生物學機制有待進一步探討，本研究結(jié)果仍需后續(xù)的研究進行驗證。

表3 miRNA-495 rs2281611和miRNA-200b rs7549819突變等位基因累計個數(shù)與697例大動脈粥樣硬化型缺血性卒中發(fā)病年齡的關聯(lián)分析

綜上所述，miRNA-495 rs2281611、miRNA-200b rs7549819多態(tài)性及二者突變等位基因數(shù)量(3～4個)均與LAA缺血性卒中發(fā)病年齡提前相關，可能有助于早期識別LAA缺血性卒中高風險人群。