楊光昕，湯云瑜，程逸凡，張婧茹，張楷文，沈曉盛，張小剛，王軍，孔聰*

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090; 2. 中國海洋大學(xué), 海洋生命學(xué)院, 青島 266003; 3. 上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司, 上海 200335)

地西泮(Diazepam, DZP)，又名安定，是一種典型的苯二氮卓類鎮(zhèn)定劑，具有鎮(zhèn)定、催眠抗癲癇、抗驚厥、戒酒等作用[1-3]，在人類臨床和獸醫(yī)臨床中使用廣泛[4-5]。長期服用DZP會產(chǎn)生一系列副作用，如易怒、嗜睡、幻聽、頭痛、乏力，甚至產(chǎn)生藥物依賴性和耐藥性[6-8]。而且，DZP在動物體內(nèi)殘留后可通過食物鏈進(jìn)入人體，威脅人體健康[9-10]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中，中國禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用DZP，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650—2019)中規(guī)定DZP不得在動物性食品中檢出。但近年來水產(chǎn)品中DZP殘留檢出事件在國內(nèi)多個省份中頻有發(fā)生[11]。在《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于監(jiān)督抽查發(fā)現(xiàn)的27批次問題農(nóng)產(chǎn)品情況的通告》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部〔2022〕3號)中[12]，有18批次問題樣品屬于水產(chǎn)品，其中在16批次問題水產(chǎn)樣品中檢出DZP殘留，涉及鯉(Cyprinuscarpio)、鳊(Parabramispekinensis)、草魚(Ctenopharyngodonidella)、鯽(Carassiusauratus)等品種，問題樣品分布在5個省份的7個地區(qū)。前期工作對大批量水產(chǎn)品進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)DZP在鯽、草魚等水產(chǎn)品中的檢出率較高[13]。曾軍杰等[14]在魚類藥物殘留大排查中發(fā)現(xiàn)多例水產(chǎn)品中含有DZP。這些報道表明目前水產(chǎn)品中DZP殘留問題較為突出，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，同時給消費者的身體健康帶來了潛在的威脅。因此，在關(guān)注水產(chǎn)品中DZP殘留量的同時，更要分析DZP的污染源，從源頭控制違禁藥物的使用。

雖然DZP在水產(chǎn)品中屢有檢出[15-16]，也引起了市場監(jiān)管部門和學(xué)者們的關(guān)注，但現(xiàn)有研究多集中于DZP檢測方法的構(gòu)建和樣品篩查，對于水產(chǎn)品中DZP的來源分析相對較少。有學(xué)者認(rèn)為生產(chǎn)經(jīng)營者在運輸環(huán)節(jié)可能會非法使用DZP來提高水產(chǎn)品成活率[17-18]，然而實驗室在樣品篩查中發(fā)現(xiàn)市售水產(chǎn)品中DZP的殘留量較低[13]，且在養(yǎng)殖產(chǎn)地采集的水產(chǎn)品樣品中也發(fā)現(xiàn)了DZP殘留，這表明運輸過程中非法使用并不是水產(chǎn)品中DZP的唯一來源。

環(huán)境水體污染是造成水生生物中污染物殘留的主要因素之一[19]，由于DZP在人體或動物內(nèi)的不完全代謝、藥物濫用等原因，該藥物可通過養(yǎng)殖廢水、生活及醫(yī)療廢水等途徑進(jìn)入自然水體，造成環(huán)境污染[20-23]。目前在世界大多數(shù)國家和地區(qū)的自然水體中均有DZP檢出[24-25]。Zhang等[26]調(diào)查了2017—2019年廈門市主要河流中新型污染物的分布特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DZP在這3年的檢出率分別為89.00%、46.00%和90.00%，檢出濃度為0.00～5.39 ng/L。水產(chǎn)品養(yǎng)殖用水大多來源于地表水，這也使得水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中可能受到環(huán)境DZP殘留的影響。劉洋峰等[27]對水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘水體進(jìn)行DZP殘留量篩查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DZP的檢出率為63.30%，其含量主要集中在10.00 ng/L，然而在受污染魚塘采集的生物樣品中并未檢出DZP，提示低濃度暴露水平下DZP可能不會在魚體內(nèi)富集[28]。

投入品是影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素，也是污染物進(jìn)入水產(chǎn)品中的重要途徑。然而本研究在前期對漁用飼料及漁藥等投入品的篩查中并未發(fā)現(xiàn)DZP及其相關(guān)藥物。目前，尚未有關(guān)于漁用飼料及漁藥中有檢出DZP的報道。因此，水產(chǎn)品中的DZP殘留可能源自其他途徑。

有研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚(Brachydanioreriovar)在16.00 μg/L和160.00 μg/L的水環(huán)境濃度中會發(fā)生群聚效應(yīng)，且更傾向于停留在DZP藥物所在的區(qū)域[29]。這一結(jié)果表明投放含有DZP的餌料可能更容易捕獲目標(biāo)物?；谶@一推斷，分析前期篩查中發(fā)現(xiàn)的陽性水產(chǎn)品樣品及其來源，發(fā)現(xiàn)陽性樣品的檢出種類大多為鯽、草魚、鳊、鯉等淡水養(yǎng)殖品種，其產(chǎn)地登記來源場所大多具備休閑垂釣功能，而垂釣過程中會消耗大量的餌料。因而，我們設(shè)想生產(chǎn)經(jīng)營者可能為了提高垂釣者的捕魚成功率，在餌料中摻雜DZP，或者餌料生產(chǎn)商為了提高餌料效果，在生產(chǎn)過程中摻雜DZP，以獲取較高的收益，這些含有DZP的餌料可能成為水產(chǎn)品中DZP的主要來源。為了驗證這一設(shè)想，我們在市場上隨機購買了35份垂釣所用的餌料，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法來篩查餌料中的DZP及其主要降解產(chǎn)物奧沙西泮(Oxazepam)、去甲地西泮(Nordiazepam)、替馬西泮(Temazepam)的含量，分析其與水產(chǎn)品中DZP殘留來源的關(guān)聯(lián)性，并進(jìn)一步評估其對水產(chǎn)品質(zhì)量安全的影響，為監(jiān)管部門提供有效的參考和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1儀器與材料

液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(液相：島津LC20AD，質(zhì)譜：AB Sciex Qtrap 5500)，配備電噴霧離子源。DZP、奧沙西泮、去甲地西泮、替馬西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液和地西泮-D5(1.000±0.005 mg/mL，美國Cerilliant公司)；乙腈、乙酸乙酯、甲醇(色譜純，美國Baker公司)；甲酸(分析純，美國sigma公司)；N-丙基乙二胺(PSA)(40～63 μm，60 ?，天津博納艾杰爾科技有限公司)；十八烷基硅烷分散固相萃取材料(C18)(40～60 μm，60 ?，上海普譽科貿(mào)有限公司)；PTFE濾膜(0.22 μm，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司)。

1.2 樣品采集與制備

以網(wǎng)購的形式隨機購買不同廠家生產(chǎn)的餌料，共計35個，樣品收到時均包裝完好。如表1所示，這些餌料樣品適用于淡水魚類[鯽、鯉、草魚、鱸(Lateolabraxjaponicus)、羅非魚(Oreochromismossambicus)等]，其產(chǎn)地分布在國內(nèi)9個省市的23個地區(qū)，形態(tài)特征主要有膏狀、干粉、濕粉、塊狀、糊狀和懸濁液，主要成分包括谷物類、動物組織、魚蝦粉和藻類等，但一些產(chǎn)品主要成分表述不清，給監(jiān)管部門和消費者選購帶來了不便。

表1 魚餌料樣品信息Tab.1 The information of fish bait samples

續(xù)表1,Tab.1 Continued

顆粒狀和塊狀的餌料樣品研磨成粉狀待用，其他樣品直接分裝、稱量后待測。

1.3 樣品前處理

前處理方法在前期工作[30]的基礎(chǔ)上，預(yù)先加入2 mL水，使餌料充分分散，在樣品萃取混合液中加入1 g NaCl，以達(dá)到有機相萃取劑和水相充分分離的效果。其他步驟與文獻(xiàn)中一致。具體方法為：準(zhǔn)確稱取2 g 樣品于50 mL 具塞離心管中，加入 60 μL內(nèi)標(biāo)溶液，充分混合后加入2 mL水，旋渦1 min，再加入5 mL乙酸乙酯，旋渦混合10 min后加入1 g NaCl，繼續(xù)旋渦 3 min，然后在4 ℃下以 4 000 r/min離心10 min，取上層提取液于玻璃管中。在剩余殘渣中加入5 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次(不重復(fù)加入NaCl)，合并乙酸乙酯提取液，氮氣吹干(或僅剩油脂)。加入1 mL 乙腈∶水(8∶2,v/v)溶液充分旋渦溶解殘留物。在復(fù)溶液中加入50 mg PSA和50 mg C18，旋渦混合10 min，靜置 5 min后過 0.22 μm PTFE濾膜待測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18Rapid Resolution HD 色譜柱(3.0 mm×150.0 mm，1.8 μm);流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相A為 5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序為：0.00～1.50 min，1% B；1.50～4.00 min，1%～90% B；4.00～6.00 min，95～99% B；6.00～6.15 min，95～99% B；6.15～8.50，99% B；8.50～8.65 min，99～1% B；8.65～10.00 min，1% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI源)；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣：40 psi；噴霧氣55 psi、輔助加熱氣：55 psi；碰撞氣：medium；質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 DZP及其降解產(chǎn)物和同位素內(nèi)標(biāo)化合物的多重反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Tab.2 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters for detection of DZP, its degradation products and isotope internal standard

2 結(jié)果與分析

2.1 方法建立及有效性評價

通過基質(zhì)加標(biāo)的方式對建立的方法進(jìn)行性能評價。首先在空白餌料中進(jìn)行低濃度水平加標(biāo)，通過檢查信噪比，確定該方法DZP、奧沙西泮、去甲地西泮、替馬西泮的最低檢出限均為0.5 μg/kg(S/N>3)，定量限均為1.0 μg/kg(S/N>10)。

在空白餌料樣品中添加已知濃度的DZP及其降解產(chǎn)物混合工作液，加標(biāo)濃度為1 μg/kg、5 μg/kg和10 μg/kg，每個濃度重復(fù)6次。結(jié)果顯示，在1～10 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，4種物質(zhì)在餌料中的回收率為77.6%～117.9%，批內(nèi)和批間變異系數(shù)不大于8.4%。這表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度，可以用來檢測魚餌料中DZP及其降解產(chǎn)物的殘留量。

2.2 樣品篩查結(jié)果

對35個魚餌料樣品進(jìn)行分析檢測，結(jié)果如表3所示，共有14個樣品檢測出DZP，檢出率為40.00%，其殘留量為1.25～82 214.00 μg/kg，典型陽性樣品中DZP的提取離子流色譜圖如圖1A所示。在檢出的餌料樣品中，有25.71%的樣品中DZP殘留量低于10 μg/kg，有2.86%的樣品中DZP殘留量在10～100 μg/kg，有11.43%的樣品中DZP殘留量在100 μg/kg以上。其中3號樣品、15號樣品、28號樣品和29號樣品中的DZP殘留量分別高達(dá)82 214 μg/kg、35 414 μg/kg、31 758 μg/kg和12 790 μg/kg。

DZP的主要降解產(chǎn)物去甲地西泮、替馬西泮和奧沙西泮在樣品中的檢出率相對較低，去甲地西泮和替馬西泮僅在4個DZP殘留量高的樣品中檢出，檢出率均為11.43%，殘留量分別為50.41～2 055.00 μg/kg和30.42～968.00 μg/kg，典型陽性樣品中DZP降解產(chǎn)物的提取離子流色譜圖如圖1B～D所示。而奧沙西泮僅在DZP殘留量最高的3號樣品中檢出，檢出率為2.86%，殘留量為4.93 μg/kg。

圖1 典型陽性樣品中DZP(A)及其降解產(chǎn)物去甲地西泮(B)、替馬西泮(C)、奧沙西泮(D)的提取離子流色譜圖Fig.1 XIC chromatograms of DZP (A) and its degradation products (B: Nordiazepam, C: Temazepam and D: Oxazepam) in a representative positive sample

2.3 樣品中DZP來源分析

DZP在魚餌料樣品中的檢出率較高，部分樣品中的殘留量非常大，而其主要降解產(chǎn)物僅在DZP殘留量最高的4個樣品中檢出，且濃度占比較低，其含量總和低于DZP含量的4.8%，其中去甲地西泮和替馬西泮的濃度與DZP的濃度比分別為0.39%～2.50%和0.24%～2.54%，奧沙西泮僅在DZP殘留量最高的樣品3中檢出，含量僅為4.93 μg/kg，與地西泮的濃度比極低。李明等[31]通過灌胃對大鼠暴露DZP，2 h 后肌肉中去甲地西泮與DZP的濃度比為14.17%。何文婷等[32]用DZP對家兔染毒，8 h肌肉中去甲地西泮與DZP的濃度比為36.70%，且隨著時間的增加，去甲地西泮的含量遠(yuǎn)超過DZP的含量。這說明DZP在生物體內(nèi)經(jīng)短時間暴露后，其代謝物占比即達(dá)到較高的水平。表明餌料中的DZP降解產(chǎn)物可能源自DZP產(chǎn)品本身所含雜質(zhì)，而不是經(jīng)生物體代謝所產(chǎn)生。同時也說明以上4份餌料中的DZP非生產(chǎn)原料中代謝殘留所致，極有可能是人為添加。不僅如此，考慮到購買餌料的成本以及人用DZP藥物的價格，生產(chǎn)者使用人用藥物直接添加到餌料中將極大增加其生產(chǎn)成本，人用藥流入餌料生產(chǎn)鏈條的可能性較低。這些結(jié)果也說明餌料生產(chǎn)加工過程中可能存在非法獲取DZP原料藥的途徑。

表3 樣品中DZP及其降解產(chǎn)物的含量檢測結(jié)果Tab.3 The contents of DZP and its degradation products in the fish bait samples

續(xù)表3,Tab.3 Continued

2.4 魚餌料中DZP的添加意圖分析

結(jié)合近年來水產(chǎn)品中DZP頻繁檢出，且陽性樣品多為鯽、草魚、鯉等與休閑漁業(yè)相關(guān)品種和來源的報道[12-13]，可以表明餌料中的DZP可能是水產(chǎn)品中DZP殘留的主要來源之一，但餌料中添加DZP的意圖尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚暴露在受DZP污染的水域中會產(chǎn)生集群效應(yīng)，且更傾向于停留在受DZP污染的區(qū)域[29]，甚至增加進(jìn)食率[33]。添加高濃度的DZP可能是為了提高餌料在垂釣中的捕魚效果。將含DZP的餌料拋灑在水中會在短時間內(nèi)形成一個含有高濃度DZP的空間環(huán)境，促使周邊的魚在這里聚集和進(jìn)食，從而達(dá)到快速捕魚的效果。高效的餌料意味著高銷量，進(jìn)而獲取高額的利益，這可能是生產(chǎn)經(jīng)營者在餌料中非法添加DZP的主要原因。

目前有很多水產(chǎn)養(yǎng)殖場所具備休閑垂釣功能，魚餌料使用量較大，在水體中拋灑含DZP的餌料，會造成大面積水體污染，進(jìn)而導(dǎo)致相關(guān)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地和品種存在較高的被動用藥風(fēng)險。DZP在環(huán)境中的代謝周期較長[34]，養(yǎng)殖魚塘屬于相對封閉的水體環(huán)境，殘留在魚塘中的DZP會長期存在于水體和底泥中，對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成長期的影響。這可能是在水產(chǎn)品和水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中頻繁檢出DZP的原因之一。此外，野外垂釣過程中使用摻雜DZP的餌料也會造成自然水體污染，給水生生物和生態(tài)環(huán)境帶來潛在的威脅。

3 結(jié)論

DZP在水產(chǎn)品中頻繁檢出，但其污染源頭尚不明確。本研究調(diào)查了漁用餌料中DZP及其降解產(chǎn)物的殘留狀況，發(fā)現(xiàn)DZP的檢出率較高，殘留量較大，最高可達(dá)82 214 μg/kg。經(jīng)分析，餌料中的DZP極有可能是人為添加所致，且存在非法原藥來源途徑，其使用來源不受監(jiān)控增加了藥物在水產(chǎn)品中污染殘留風(fēng)險，這可能是造成養(yǎng)殖環(huán)境污染、水產(chǎn)品中頻繁檢出DZP的主要原因。

餌料是捕魚過程中的重要投入品，然而目前關(guān)于餌料中違禁藥品使用情況的研究相對較少。本研究認(rèn)為針對DZP在水產(chǎn)品和養(yǎng)殖環(huán)境中的殘留現(xiàn)狀應(yīng)進(jìn)行以下應(yīng)對措施：一是對餌料中DZP的原材料來源進(jìn)行調(diào)查；二是理清使用DZP的原因，尋找合法安全替代方案；三是研究暴露后在水產(chǎn)品的代謝與消除規(guī)律；四是調(diào)查環(huán)境中DZP的分布特征以及評估DZP對水產(chǎn)品、生態(tài)環(huán)境和人體健康的長期影響。