王路明 曹瀟 仵琳悅 李蘊聰 雷波 牛林

1.西安交通大學陜西省顱頜面精準醫(yī)學研究重點實驗室 西安 710004；2.西安醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院口腔科 西安 710038；3.西安交通大學前沿科學技術研究院 西安 710054

復合樹脂以其優(yōu)異的美學效果及良好的力學性能在臨床上廣泛應用于牙體缺損修復[1]，但與其他牙科修復材料相比，復合樹脂容易產(chǎn)生聚合收縮，這種收縮會破壞充填體的邊緣封閉性，在充填體與牙體組織之間形成微滲漏。此外，口腔微環(huán)境中的細菌容易在其表面黏附、聚集，形成菌斑生物膜，從而導致繼發(fā)齲的產(chǎn)生[2]。為了克服這些缺陷，在復合樹脂材料中添加具有抗菌生物效應的組分，研發(fā)能夠抑制細菌黏附和生長的牙科復合樹脂材料具有重要的臨床意義。另外，預防釉牙本質(zhì)脫礦的同時促進脫礦組織再礦化，也是減少繼發(fā)齲發(fā)生，提高樹脂充填修復成功率的有效策略[3-4]。近年來，生物活性玻璃以其良好的生物活性、生物相容性、骨傳導性、組織礦化能力等在器官損傷修復[5]、癌癥治療[6]等方面的應用得到了廣泛關注。鋅元素是人體必需的微量元素之一，鋅及其氧化物有著長效且安全穩(wěn)定的抗菌特性[7]。若將兩者的優(yōu)勢結(jié)合起來對復合樹脂進行改性，增強復合樹脂的抗菌性能和促進牙體組織再礦化的能力，將大大改善目前復合樹脂性能的不足。本實驗采用溶膠-凝膠模板法，在十二胺催化下制備摻鋅生物活性玻璃納米顆粒（Zn-doped bioactive glass nanoparticles，Zn@BGN），再用其對復合樹脂改性，對改性后的復合樹脂力學性能進行初步研究，同時篩選適宜的Zn@BGN添加比例，為進一步探討Zn@BGN改性復合樹脂的抗菌性能及再礦化能力提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料儀器

1.1.1 主要原料去離子水、無水乙醇（C2H6O）、十二胺[dodecylamine；CH3(CH2)11NH2]、正硅酸乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS；C8H20O4Si）、磷酸 三 乙 酯（triethylphosphate，TEP；C6H15O4P）、四水硝酸鈣[calcium nitrate tetrahydrate，CN；Ca(NO3)2·4H2O]、六 水 硝 酸 鋅[zinc nitrate hexahydrate，ZN；Zn(NO3)2·6H2O]，γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷kh-570[γ-ethacryloxy propyl trimethoxyl silane；CH3CCH2COO(CH2)3Si(OCH3)3]，以上材料均為薩恩化學技術（上海）有限公司產(chǎn)品。樹脂體系采用雙酚A雙甲基丙烯酸縮水甘油酯（bisphenol A glycerolate dimethacrylate，BisGMA）和雙甲基丙烯酸二縮三乙二醇酯（triethylene glycol dimethacrylate，TEGDMA）的混合物（Bis-GMA∶TEGDMA質(zhì)量比為50∶50），0.7 μm硅化鋇硼酸鹽玻璃填料[silinated 0.7 micron Bbas（boron barium sulfate）glass]，以上材料均為美國Esstech公司產(chǎn)品。引發(fā)體系包括光引發(fā)劑樟腦醌（camphorquinon，CQ）及光促進劑胺活化劑甲基丙烯酸二甲氨基乙酯[2-(Dimethylamino)ethyl methacrylate，DMAEMA]，均為美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器分析天平（BSA2245型，Sartorius公司，德國），磁力恒溫攪拌器（RH digital&ETS-D5型，IKA公司，德國），高速離心機（Multifuge X1型，Thermo公司，美國），渦旋振蕩器（VoRTEX GENIUS 3型，IKA公司，德國），超聲振蕩器（KQ5200DE型，昆山超聲儀器有限公司），冷凍干燥機（LABCONCO公司，美國），馬弗爐（KSL-1200X型，合肥科晶材料技術有限公司），恒溫振蕩器（IS-RSD3型，CRYSTAL公司，美國），電熱鼓風干燥箱（DHG-9140A型，上海一恒科學儀器有限公司），數(shù)顯游標卡尺（500-196-30型，Mitutoyo公司，日本），光固化機（LED-F PLUS型，中國啄木鳥醫(yī)療器械有限公司），萬能材料測試機（AGS-10kNG/500N型，島津公司，日本），多功能數(shù)顯顯微硬度儀（MHVD-1000IS型，上海鉅晶精密儀器制造有限公司），透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM；H7700型，HITACHI公司，日本），場發(fā)射掃描電子顯微鏡X射線光電子能譜儀（field emission scanning electron microscope/X-ray energy dispersive spectrometers，EDS；Quanta 250 FEG型，F(xiàn)EI公司，美國），X射線衍射儀（X-ray powder diffractometer，XRD；Bruker D8 ADVA-NCE型，Bruker AXS公司，德國）。

1.2 Zn@BGN的制備

使用溶膠-凝膠模板法，在十二胺催化下制備不同質(zhì)量分數(shù)的Zn@BGN（表1）。將2 g十二胺、12.5 mL去離子水和40 mL無水乙醇加入燒瓶中，置于40℃的恒溫磁力攪拌器上，充分攪拌15 min形成催化反應模板，先滴加500 μL TEOS，間隔10 min后再滴加500 μL TEOS，攪拌30 min后緩慢滴加103 μL TEP，繼續(xù)攪拌30 min，按照表1所列的不同的摻鋅質(zhì)量分數(shù)（1.6%、2.6%、6.4%）依次加入已充分水解的CN和ZN，攪拌3 h后離心（10 000 r·min-1，15 min），去上清后加入無水乙醇洗滌3次，每次均使用超聲振蕩器及渦旋振蕩器充分振蕩后離心（10 000 r·min-1，5 min），去上清，再使用去離子水洗滌3次，得到生物活性納米顆粒（bioactive glass nanoparticles，BGN）以及不同摻鋅質(zhì)量分數(shù)（1.6%、2.6%以及6.4%）的Zn@BGN凝膠，預凍后置入冷凍干燥機干燥，最后經(jīng)過馬弗爐600℃煅燒以去除結(jié)晶水和硝酸根，得到白 色BGN以 及3組 實 驗 組Zn@BGN粉 末（1-Zn@BGN、2-Zn@BGN和6-Zn@BGN）。

表1 不同摻鋅比例BGN各組分質(zhì)量分數(shù)Tab 1 Different proportion of Zn@BGN mass fraction of components %

1.3 Zn@BGN微觀表征

取適量的BGN及3個實驗組的Zn@BGN粉末，加入含有無水乙醇的小燒杯中，置于超聲振蕩器上振蕩15～30 min，使之分散均勻。用毛細玻璃管吸取已振蕩均勻的混合液，滴于銅網(wǎng)表面的碳支持膜上，確保樣本均勻分布在支持膜上。待無水乙醇揮發(fā)完后，使用TEM對材料的形貌、粒徑及分散性進行觀察。另取適量樣本，采用EDS進行面掃描，對樣本元素成分進行測定。

1.4 材料體外生物活性檢測

將BGN及Zn@BGN粉末按照1 g·L-1的質(zhì)量濃度分別加入含有20 mL模擬體液（simulated body fluid，SBF）[8]的聚乙烯瓶中，將其固定在恒溫振蕩器中（120 r·min-1，37℃）持續(xù)搖動，經(jīng)過10 d的反應后，過濾溶液，丙酮沖洗終止反應，去離子水洗滌，離心（10 000 r·min-1，5 min）3次，之后將其放入干燥箱中60℃干燥2 h獲得反應后的材料。使用XRD對反應后材料進行連續(xù)掃描（10°～80°），XRD工作條件：Cu靶Kα射線，管電壓40 kV，管電流100 mA。通過XRD圖譜中呈現(xiàn)的磷灰石（hydroxyapatite，HA）特征峰判斷材料的體外活性[9]，篩選Zn@BGN中適宜的摻鋅比例。將篩選出的摻鋅比例適宜的Zn@BGN進行硅烷化處理，備用。

1.5 Zn@BGN改性復合樹脂的制備

參照表2中復合樹脂各組組分的配比，稱取樹脂體系（BisGMA/TEGDMA），避光環(huán)境下依次加入光引發(fā)體系（CQ和DMAEMA）、硅烷化的無機填料及1-Zn@BGN（通過上一步實驗篩選得出）。制備對照組復合樹脂和3個實驗組復合樹脂。對照組：未添加Zn@BGN改性樹脂；實驗組1：Zn@BGN-10改性樹脂；實驗組2：Zn@BGN-15改性樹脂；實驗組3：Zn@BGN-20改性樹脂。

表2 實驗用復合樹脂各組分的質(zhì)量分數(shù)Tab 2 The composite resin mass fraction of each composition %

1.6 復合樹脂機械性能測定

1.6.1 撓曲強度（flexural strength，F(xiàn)S）依據(jù)ISO4049標準，用于FS測試試件的尺寸為長（l）25 mm，寬（w）2 mm，高（h）2 mm。將復合樹脂充分填塞于定制的聚四氟乙烯磨具中，光固化燈燈頭置于垂直于試件表面5 mm處，從前段、中段、后段依次照射，每個部位照射10 s，正反面相同（正面共30 s，反面共30 s），固化后脫模，打磨光滑，使用數(shù)顯游標卡尺復測試件尺寸，37℃水浴中存儲24 h，備用。使用萬能材料試驗機進行測試（跨距L為20 mm，速度為0.5 mm·min-1，傳感器量程為10 kN），記錄破壞載荷F。根據(jù)公式FS=3FL/2wh2計算FS。

1.6.2 徑向拉伸強度（diametral tensile strength，DTS）依據(jù)美國國家標準，用于DTS測試試件的尺寸為直徑（d）6 mm，高（h）3 mm。將復合樹脂充分填塞于定制的聚四氟乙烯磨具中，光固化燈充分光照（正面30 s，反面30 s），固化后脫模，打磨光滑后，用數(shù)顯游標卡尺復測試件尺寸，在37℃水浴中存儲24 h，備用。使用萬能材料試驗機進行測試（速度為0.5 mm·min-1，傳感器量程為10 kN），記錄破壞載荷F。根據(jù)公式DTS=2F/πdh計算DTS。

1.6.3 壓縮強度（compression strength，CS）依據(jù)美國國家標準，用于CS測試試件的尺寸為直徑（d）4 mm，高（h）6 mm。將復合樹脂充分填塞于定制的聚四氟乙烯磨具中，光固化燈充分光照（正面30 s，反面30 s），固化后脫模，打磨光滑后，用數(shù)顯游標卡尺復測試件尺寸，在37℃水浴中存儲24 h，備用。使用萬能材料試驗機進行測試（速度為0.5 mm·min-1，傳感器量程為10 kN），記錄破壞載荷F。根據(jù)公式CS=F/πr2（r=1/2d）計算CS。

1.6.4 維氏硬度（Vickers hardness，HV）依據(jù)ISO4049標準，用于HV測試試件的尺寸為長（l）6 mm，寬（w）5 mm，高（h）3 mm。將復合樹脂充分填塞于定制的聚四氟乙烯磨具中，光固化燈充分光照（正面30 s，反面30 s），固化后脫模，測試面高度拋光至鏡面狀，其余面打磨光滑，用數(shù)顯游標卡尺復測試件尺寸，37℃水浴中保存24 h，備用。使用多功能數(shù)顯顯微硬度儀對每個試件測試面取隨機8個點進行測試，每個點加載力為0.98 N，保持5 s，得出各點的HV，計算每個試件的HV平均值。

1.7 統(tǒng)計學分析

本實驗采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，經(jīng)過方差齊性及正態(tài)性檢驗后，進行單因素方差分析，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 材料TEM表征

TEM微觀檢測顯示：各組Zn@BGN粒徑均在150 nm左右，形態(tài)規(guī)則，單分散性好（圖1），與對照組BGN無明顯差異。EDS元素分析顯示結(jié)果與生物活性玻璃（SiO2-CaO-P2O5）相符（圖2）。

圖1 摻鋅生物活性玻璃納米顆粒TEM照片F(xiàn)ig 1 TEM photos of Zn@BGN

圖2 摻鋅生物活性玻璃納米顆粒EDS元素分析圖Fig 2 EDS element analysis diagram of Zn@BGN

2.2 體外生物活性

從XRD圖譜中可以看出，BGN出現(xiàn)了HA特征峰，與2-Zn@BGN、6-Zn@BGN相比，當摻鋅質(zhì)量分數(shù)為1.6%（1-Zn@BGN）時，XRD圖譜中也出現(xiàn)了HA特征峰（圖3），由此通過體外HA實驗篩選出了與BGN具有相同活性的合適摻鋅比例。后續(xù)力學性能研究均采用1-Zn@BGN（以下簡稱Zn@BGN）進行測試。

圖3 XRD圖譜中HA特征峰圖Fig 3 XRD spectrum of HA characteristic peaks

2.3 Zn@BGN改性復合樹脂力學性能

改性復合樹脂力學性能測試結(jié)果見圖4：Zn@BGN添加質(zhì)量分數(shù)為10%和15%時，4項力學性能與對照組的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；當Zn@BGN的質(zhì)量分數(shù)增加到20%時，F(xiàn)S和DTS性能下降，差異與對照組相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。由此可以看出，Zn@BGN添加質(zhì)量分數(shù)為15%及以下時，不影響復合樹脂的力學性能。

圖4 改性復合樹脂力學性能Fig 4 Mechanical properties of modified composite resin

3 討論

20世紀60年代，Hench等研發(fā)了生物活性玻璃45S5，化學組分為Na2O-CaO-SiO2-P2O5[10]。因其具有良好的生物相容性和較高的骨修復能力[11]，以及促進生物礦化及提高細胞活性等優(yōu)越性能，在口腔醫(yī)學領域已被廣泛應用[12]。20世紀70年代Hench等又研制出熔融法來制備生物活性玻璃[13]。該方法類似于傳統(tǒng)玻璃制備，即將一定量組成的原料混合，通過高溫下熔融（1 300～1 500℃），最后淬冷得到最終產(chǎn)物。雖然該方法制備的生物活性玻璃在當時具有比較好的生物相容性及較高的骨修復能力，但其制備缺點十分明顯。熔融法要求條件高，能耗大[14]，得到的產(chǎn)物結(jié)構密實無孔[15]，組成不均勻，比表面積較小[16]。直到20世紀90年代，Hench等又研制出了溶膠-凝膠法，并且成功制備58S、77S等生物活性玻璃，化學組分為SiO2-CaO-P2O5[17]。研究[15,18]表明，該方法的優(yōu)點是可以在室溫下制備，并可達到分子級別，大大提高了產(chǎn)品的結(jié)構均勻性，不會像熔融法所制備的那樣密實無孔，而是具有大量的微納米介孔，同時具有較高的比表面積和化學活性，從而提高了生物活性[12,15]。但此方法制備的生物活性玻璃因其顆粒容易發(fā)生團聚，嚴重影響了材料的分散性，即便通過后期篩分研磨[19-20]仍然欠佳，對其顆粒形態(tài)及尺寸的調(diào)控非常困難且繁瑣。

本實驗采用溶膠-凝膠模板法，在十二胺催化下制備出生物活性玻璃納米顆粒，改善了之前合成方法的不足，而且十二胺同時具備模板劑和催化劑的雙重作用[20]。通過十二胺的質(zhì)量濃度可以控制生物活性玻璃的粒徑和單分散性[20-21]。在本實驗配置的十二胺質(zhì)量濃度的催化下，制備出的BGN及Zn@BGN均呈現(xiàn)出規(guī)則的納米球狀顆粒，粒徑約150 nm，大小較均一，單分散性良好（圖1），得到了理想的生物活性玻璃納米顆粒。原因考慮可能是由于十二胺的質(zhì)量濃度不同導致了溶液堿性的變化[21]。在溶液堿性較低時，反應物的水解速率比較慢，在相同反應時間內(nèi)顆粒不能迅速均勻長大，故無法形成均勻的球狀顆粒；但隨著溶液堿性的升高，反應物的水解及聚合速度同時加快，相同時間內(nèi)水解的產(chǎn)物有更多的時間與周圍的水解產(chǎn)物發(fā)生均勻碰撞，聚合增大，從而形成較均勻的納米玻璃微球[8,20-22]。

復合樹脂主要由樹脂基質(zhì)和硅烷化無機填料構成，其中無機填料的含量、顆粒的大小及形態(tài)、分布是否均勻均可對其機械性能產(chǎn)生影響[23]，所以復合樹脂中的填料并不見得越多越好。填料過多時會發(fā)生團聚，無法均勻分散，樹脂連續(xù)相也同樣會遭到破壞，使其各項力學性能指標下降。因此，常見的無機填料質(zhì)量分數(shù)為60%～70%[24]。本實驗中無機填料的總添加比例設定為70%，Zn@BGN則是對無機填料進行一定比例的替代。本實驗中的BGN及Zn@BGN均已經(jīng)過硅烷化處理，目的是提高與樹脂基質(zhì)的相容性[25]，提升樹脂的力學性能。已有研究[26]表明：樹脂基質(zhì)中摻入已硅烷化的生物活性玻璃，依然能較快速地釋放出鈣、磷等離子，誘導HA的生成。

力學性能測試結(jié)果顯示：Zn@BGN添加質(zhì)量分數(shù)為10%、15%時，F(xiàn)S、DTS、CS和HV與對照組的差異均無統(tǒng)計學意義，但添加質(zhì)量分數(shù)增加到20%時，Zn@BGN改性復合樹脂的FS和DTS出現(xiàn)了明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。CS和HV雖然也有下降，但與對照組未見明顯差異。FS和DTS降低的原因可能是納米填料添加量達到20%后，樹脂基質(zhì)中出現(xiàn)了納米顆粒團聚的現(xiàn)象，導致分布不均勻，從而出現(xiàn)樹脂強度不一及樹脂基質(zhì)不均勻聚合收縮的情況[27]，這種情況可導致應力容易集中在這些不均勻的部位從而產(chǎn)生裂紋，并且容易在這些部位擴展開來[28]，影響其力學性能。在20%添加量下，CS和HV與對照組無明顯差異，可能是因為CS和HV與FS和DTS測試原理不同所致。FS和DTS主要反應材料的韌性，以點線受力的方式測試，容易在分布不均的位置產(chǎn)生線性應力集中，造成斷裂；而CS測試是將壓力以面分散給整個柱形材料，不容易出現(xiàn)點或線的應力集中，所以產(chǎn)生的破壞沒有FS和DTS反應的那么直接。此外，樹脂的壓縮性能本身要高于徑向拉伸性能[29]，這與本實驗的結(jié)果有一致性。納米顆粒的摻入會在復合樹脂的表層形成納米層，起初表面硬度會有所提高，但隨著納米材料摻入量的增加，表層的顯微硬度會逐漸下降[30]。之所以HV與對照組未見差異，可能是由于Zn@BGN摻入量未達到出現(xiàn)表層硬度明顯下降的拐點，而且無機填料的尺寸、組成及分布都有可能是影響硬度的因素[31]。

本實驗采用溶膠-凝膠模板法，在十二胺催化下制備出了粒徑大小均勻、單分散性良好且生物活性優(yōu)異的Zn@BGN。利用其對復合樹脂進行改性，Zn@BGN添加量為15%時，不影響改性復合樹脂的力學性能，為進一步研究Zn@BGN改性復合樹脂的抗菌性能及其再礦化能力提供了理論支持。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。