趙曼竹 宋錦璘

1.重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔綜合科 重慶 401147；2.重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院 重慶 401147

時間生物學（chronobiology）是研究機體生物節(jié)律及其應用的科學，也是一門新興的生命科學領域的交叉性學科。生物節(jié)律作為生命活動的基本特征之一，存在于單核細胞、動物、植物，乃至人類的所有生命活動中，依照周期的長短可以分為短日節(jié)律（wltradian rhythm）、近日節(jié)律（又稱晝夜節(jié)律，circadian rhythm）和長日節(jié)律（infradian rhythm）等，其中晝夜節(jié)律的研究最為普遍[1-2]。Science曾多次將這一領域評為“最有可能取得重大突破的領域”。2017年，Jeffreg Hall、Micheal Rosbash和Micheal Young因其在“晝夜節(jié)律調控分子機制發(fā)現(xiàn)”方面的奠基性貢獻而獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎[3]，足以證明晝夜節(jié)律的重要性和學者們的關注度。

晝夜節(jié)律是由一系列時鐘基因周期性表達與相互作用實現(xiàn)的。近年來，時鐘基因在口腔醫(yī)學領域的研究取得了顯著的進展，特別是在牙齒發(fā)育中有著重要影響[4]。牙齒硬組織發(fā)育開始于釉牙本質界髓角處，之后節(jié)律性地向頸部及面發(fā)育，即每天形成定量的一層基質，再礦化形成牙齒硬組織。這種周期性礦化留下了節(jié)律性痕跡，如釉質中的釉柱橫紋、芮氏線等[5]，牙本質中的馮·埃布納線[6]，牙骨質中的纖維牙板[7]。隨著研究的不斷深入，時鐘基因在牙齒發(fā)育中的表達特點與調控作用被逐漸揭開面紗，本文對此作一綜述。

1 時鐘基因的反饋抑制理論

隨著研究的不斷深入，學者們發(fā)現(xiàn)時鐘基因不僅表達于中樞系統(tǒng)，在外周組織也有表達。在哺乳動物中，晝夜節(jié)律的中樞振蕩器存在于下丘腦視交叉上核區(qū)（suprachiasmatic nucleus，SCN），主要通過感受外界光線的明暗刺激，在調控中起主導作用。除中樞振蕩器，外周組織中也存在著相似的生物鐘振蕩器，如肝臟、心臟、肌肉、白色脂肪組織等[1]。晝夜節(jié)律的調控需要中樞和外周振蕩器同步協(xié)調，由一系列的轉錄翻譯正負反饋通路組成。1990年提出的“反饋抑制理論”，用以解釋周期蛋白含量振蕩現(xiàn)象[8-9]。

反饋抑制理論示意圖見圖1：晝夜節(jié)律正向調節(jié)因子Bmal1（brain and muscle aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 1）和Clock（circadian locomotor output cycles kaput）在細胞核內形成異源二聚體，共同結合于其靶基因Per（Period）和Cry（cryptochrome）啟動區(qū)的E-box（Ephrussibox）元件，激活轉錄信使RNA，進入細胞質不斷翻譯產生Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2蛋白等目的蛋白。當目的蛋白在細胞質中逐漸聚集達到一定濃度后，可被細胞質中的酪蛋白激酶1ε磷酸化，隨后穿梭至細胞核，與Bmal1/Clock二聚體競爭結合含有E-box序列的轉錄啟動子，從而發(fā)揮負向作用，實現(xiàn)周期蛋白的24 h周而復始振蕩，構成晝夜節(jié)律的分子生物學基礎。除Per和Cry以外，Rev-Erb（reverse orientation c-erb）和Ror（RAR-related orphan receptor）也參與維持這個反饋通路的正常運行，即Bmal1/Clock二聚體通過結合Rev-Erb和Ror啟動區(qū)的E-box元件，激活表達Rev-Erb和Ror蛋白，這些蛋白進入細胞核直接結合Bmal1、Clock的增強子Rore元件；但兩個因子發(fā)揮的作用不同，Rev-Erb發(fā)揮抑制作用，Ror促進Bmal1、Clock基因的轉錄和表達。正是生物鐘系統(tǒng)內各關鍵因子的協(xié)調作用，有序調節(jié)下游的時鐘控制基因表達，才實現(xiàn)機身內復雜的生物節(jié)律活動[10-12]。

圖1 核心時鐘基因的反饋抑制理論示意圖Fig 1 Schematic diagram for the feedback loop of core clock genes

2 時鐘基因對干細胞增殖與分化的影響

2.1 胚胎干細胞

有研究[13-14]報道，時鐘基因（如Bmal1、Per2等）在胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）內不呈現(xiàn)晝夜節(jié)律的表達特點；然而當ESCs被誘導分化后，則表現(xiàn)出晝夜節(jié)律的表達特點，所以學者們認為時鐘因子可能參與ESCs分化的調控。另有研究[12]發(fā)現(xiàn)：Clock基因敲除后，ESCs呈現(xiàn)自然分化現(xiàn)象，推測Clock在多能干細胞向分化轉化的信號通路中發(fā)揮重要調控作用。還有研究[15-16]發(fā)現(xiàn)，去分化逆轉產生的誘導型干細胞（induced pluripotent stem cells，iPDCs），同樣失去了晝夜節(jié)律特點，也表現(xiàn)為ESCs相似的增殖與多能干性，進一步證實了以上有關時鐘基因參與ESCs分化調控的觀點。干細胞增殖方面的研究顯示：Bmal1通過Rev-Erba的響應元件RREs調控細胞周期檢查點基因p12，從而調控細胞周期由靜止期G1期進入DNA合成期S期[17]；此外，Per2也會通過其協(xié)同因子調控另一檢查點基因p16，調控細胞周期由DNA合成后期G2期進入有絲分裂期M期[18]。基于目前的研究，學者們[12]認為：正因為ESCs沒有晝夜節(jié)律的特點，增殖過程中不存在間歇期，從而表現(xiàn)出時鐘基因對ESCs增殖的促進作用。

2.2 成體干細胞

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可表達時鐘基因，且參與成骨分化調控。據(jù)報道[19]：骨髓來源的MSCs表達時鐘因子Per1。另有研究[20-21]顯示：從Bmal1全敲除和選擇性敲除小鼠分離培養(yǎng)的MSCs成骨分化潛能受損；增齡引發(fā)的Bmal1表達下調，MSCs的體外增殖與成骨分化潛能均下降，提示時鐘因子Bmal1具有正向調控MSCs的成骨潛能。Per1/Per2或Cry1/Cry2雙敲除小鼠的骨沉積率和骨小梁量均有顯著提升，提示時鐘因子Per1/Per2或Cry1/Cry2可負向調控骨改建[22]。過表達Bmal1的成纖維細胞NIH3T3-E1可顯著提升Runt相關轉錄因子（runt-related transcription factor，Runx）和骨鈣素（osteocalcin，OCN）等的表達，進一步證實Bmal1具有正向調控成骨的作用[23]。在牙源性成體干細胞的研究中，Zheng等[24]報道：4種主要的時鐘基因Bmal1、Clock、Per1、Per2在牙囊組織中均有表達。還有研究[25]在牙髓干細胞中檢測到Bmal1、Clock、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2時鐘基因的表達，具有晝夜振蕩特性，且受含羞草堿、棘球霉素和缺氧條件的影響。本課題組在前期體外實驗[26-27]中也發(fā)現(xiàn)，大鼠外胚間充質干細胞表達Bmal1、Clock、Per1、Per2，除Clock外，其他3個因子同樣表現(xiàn)出節(jié)律表達的特點。在牙源性干細胞與其他組織來源的干細胞的對比研究中，Bmal1、Per2、Rev-Erba在脂肪干細胞中的節(jié)律表達特點最明顯，其次是骨髓間充質干細胞，而在牙髓干細胞中的節(jié)律表達不明顯?？赡艿脑蛟谟谥靖杉毎芡饨绻獍底兓绊懽畲螅浯问枪撬栝g充質干細胞，而牙髓干細胞被保護在牙齒硬組織中，所受影響最小[28]。

3 時鐘基因在牙胚發(fā)育中的表達特點

對小鼠牙齒發(fā)育的動態(tài)追蹤觀察研究[24]顯示：蕾狀期（E14）和帽狀期（E15）牙胚中均未見時鐘基因表達，當牙胚進入鐘狀期（E17）時，時鐘基因呈現(xiàn)高表達，所檢測的4個時鐘基因（Bmal1、Clock、Per1、Per2）中，Per1表達最強，Per2和Clock呈相似的表達分布特點，但Per2表達更強；時鐘基因不僅在成釉細胞和成牙本質細胞中表達，在牙乳頭和牙囊細胞中也有表達。

對出生后1 d的小鼠牙胚進行研究[29]發(fā)現(xiàn)：部分釉基質蛋白（enamel matrix proteins，EMPs）如成釉蛋白（ameloblastin，Ambn）、釉原蛋白（amelogenin，Amelx）等呈現(xiàn)晝夜節(jié)律表達的特點，即夜間表達水平降低，但時鐘節(jié)律經典基因Bmal1、Clock、Per1、Per2在牙胚中的夜間表達卻呈上升特點，并發(fā)現(xiàn)微小RNA可能參與調控牙胚發(fā)育過程中牙齒硬組織的周期性礦化。出生后4 d，Bmal1、Clock、Per1、Per2在成釉細胞和成牙本質細胞中均有表達，Bmal1在成牙本質細胞中的表達強于成釉細胞；Per2的表達分布特點與Clock相同，但Per2表達更強，兩者不僅在成釉細胞和成牙本質細胞中表達，在牙槽骨中也可被檢測到；Per1的表達相對較弱，但在牙槽骨中表達較強[24]。另有研究[4]報道，時鐘因子Bmal1在出生后4 d小鼠牙胚的內釉上皮、中間層、星網狀層以及成牙本質細胞層均有表達，而且另一時鐘因子Cry1呈現(xiàn)同樣的表達分布模式。出生后21 d，Per2在小鼠切牙的成牙本質和成釉細胞中強表達，冠切端表達極弱甚至不表達；在磨牙牙本質細胞、上皮剩余、牙槽骨的成骨細胞核中均有強表達，牙周膜中有表達，牙髓和牙骨質中不表達[24]。

4 時鐘基因參與調控牙齒硬組織生成的機制研究

Ohtsuka和Shinoda[30]發(fā)現(xiàn)大鼠切牙短周期增量線出現(xiàn)在出生后7～10 d，晝夜增量線出現(xiàn)在12～15 d，從而認為SCN對牙齒硬組織的生長線有調控作用，而且SCN對晝夜光暗的反應和功能成熟大約在出生后2周左右。還有研究[31]報道：SCN損傷會導致鼠切牙釉質和牙本質增量線紊亂，初步證實晝夜節(jié)律參與牙齒硬組織生成的調控。也有相反的研究[32]發(fā)現(xiàn)：SCN單側或雙側喪失功能后，短周期和晝夜增量線均未出現(xiàn)明顯改變。通過生物信息學分析人、大鼠和小鼠的Amelx、Ambn、釉蛋白（enamelin，Enam）、基質金屬肽酶（matrix metalloproteinase，Mmp20）基因上游區(qū)域中的E-box元件顯示：在Amelx中，人和小鼠各有1個E-box，大鼠沒有；Ambn中，人有3個E-box，大鼠有2個E-box，小鼠沒有；而Enam只有人有1個E-box；Mmp20中3個種屬均有多個E-box[4]。以上研究表明：SCN、Bmal1、Clock、Per1、Per2等時鐘因子均參與硬組織增量線的生成調控，但牙齒硬組織的節(jié)律調控機制更為復雜，都不是缺一不可的，確切的分子機制仍需要進一步深入研究。

成釉細胞和成牙本質細胞是牙齒硬組織生成的最重要的功能細胞。研究[33]顯示：Bmal1和Per2在成釉細胞中均呈周期性表達，但2個峰值出現(xiàn)的時間節(jié)點剛好相反。Per2在進入夜間前呈現(xiàn)峰值，進入夜間后開始下降，這一振蕩特點與Amelx表達模式高度一致，進而發(fā)現(xiàn)釉基質內的溶酶體相關膜受體（lysosome-associated membrane protein，Lamp1）、碳酸酐酶2（carbonic anhydrase，Car2）、碳酸氫鈉協(xié)同轉運子（solute carrier family 4 member 4，Slc4a4）3個因子與Per2呈相反的振蕩規(guī)律，即夜間表達量顯著增加[4,34]。這3個因子均與礦化密切相關，也印證了釉基質生成白天多、礦化沉淀夜間多的規(guī)律，同時也提示Bmal1可能促進礦化，Per2抑制礦化。另有研究[28,33]報道，成釉細胞中Per2、Bmal1、過氧化物酶增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）、Amelx均呈節(jié)律振蕩表達，Per2敲除后成釉分化能力下降；進一步發(fā)現(xiàn)Per2通過信號軸PPARγ/AKT1/β-catenin（PPARγ/protein kinase B/beta-catenin）正向調控Amelx表達、釉基質分泌和礦化能力。這一結論在動物實驗[33]中得到印證，即在無晝夜明暗變化環(huán)境下懷孕2周的小鼠牙胚中，Per2、Bmal1、Amelx、PPARγ、AKT1、βcatenin表達下降；繼續(xù)觀察出生后小鼠，發(fā)現(xiàn)切牙萌出速度下降，提示晝夜明暗變化促進成釉分化與硬組織生成。成牙本質細胞同樣呈現(xiàn)晝夜節(jié)律的特點，白天分泌的膠原蛋白是夜間的2倍，而且也表達時鐘基因，表達規(guī)律與成釉細胞存在差異[31]。本課題組前期研究[27-28]也發(fā)現(xiàn)：作為牙本質、牙骨質、牙槽骨和牙髓的生成細胞，神經嵴來源的外胚間充質干細胞（ectomesenchymal stem cells，EMSCs）節(jié)律性振蕩表達per1、per2，且與低親和力神經營養(yǎng)因子受體（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）密切相關，p75NTRExIII-/-敲除小鼠切牙的每日礦化量顯著低于野生型和雜合子小鼠。另有研究[35]證實：p75NTR啟動子上的E-box中的-1039位點可與Clock/Bmal1二聚體結合，影響生物節(jié)律基因Per1、Per2、Rev-Erba等的表達，參與晝夜節(jié)律調控。綜上所述，在牙齒硬組織周期性礦化生成過程中，核心時鐘轉錄因子不僅調控核心時鐘基因的表達，也調控時鐘控制基因（clockcontrolled genes，CCGs）的 表 達，如Amelx、Lamp1、p75NTR等，共同參與牙發(fā)育的晝夜節(jié)律調控（圖2）[36]。

圖2 時鐘基因和時鐘控制基因的信號調控通路示意圖Fig 2 Schematic diagram for the signal pathways of clock genes and clock-controlled genes

5 小結與展望

目前，時鐘基因在牙胚組織中表達已基本被證實，牙齒硬組織，特別是釉質和牙本質具有節(jié)律生成的特點。時鐘基因在牙齒胚胎礦化初期（即鐘狀期）開始表達，參與多種成牙關鍵基因的表達調控（如Amelx、Ambn、Mmp20、Car2等）。然而，晝夜節(jié)律參與牙齒硬組織周期性礦化活動的調控機制研究還很少，時鐘因子的調控作用與機制也相當復雜，確切的分子機制仍需要進一步深入研究。

時間生物學的出現(xiàn)將生命科學研究思維由靜態(tài)轉向了動態(tài)，晝夜節(jié)律分子機制的相關研究成果獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，也證明學者們普遍認同生物節(jié)律在生命科學中的重要性。相信隨著研究的不斷深入，時鐘基因在牙齒發(fā)育中的調控作用與分子機制將被逐步揭示，啟發(fā)學者用更多的視角解析牙齒發(fā)育理論，提出更科學的牙再生策略，早日實現(xiàn)再生人類的“第三副牙齒”。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。