宋佳琪，付正豐，陳 浩，蔡恩博*，楊利民，韓佳宏

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶 404020）

癌癥是當今社會嚴重威脅人類身體健康和生命安全的疾病，2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示：我國新發(fā)癌癥病例457萬例，占全球24%；死亡病例300萬例，占全球30%［1］?；熓悄壳芭R床治療癌癥的主要方法之一，但化療在消滅癌細胞的同時對機體正常細胞也產(chǎn)生了極大的損壞。骨髓抑制是化療中最為常見的毒副作用，因為在抑制或殺死腫瘤細胞的同時化療藥物也會對骨髓中的造血干細胞造成傷害，減弱造血干細胞的分化能力及其造血干性［2］，從而導致血細胞降低，患者被迫減少藥量甚至中止化療，最終影響化療效果［3］。因此，對眾多惡性腫瘤患者來說，改善化療所致的骨髓抑制至關重要，亟待解決。

中醫(yī)藥學歷史悠久，在中華民族的繁衍昌盛中做出過巨大貢獻，歷代醫(yī)家編纂的經(jīng)典古籍和從臨床實踐中歸納總結的診治方略更是無價之寶，對現(xiàn)今很多疑難雜癥的治療都具有指導意義。有大量研究表明，中藥對化療所引起的骨髓抑制具有顯著的療效，如杞萸六君湯［4］、生血湯［5］、加味六味地黃丸［6-7］等，而方中無不以人參-山茱萸組方。

經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學院第一臨床醫(yī)院副主任醫(yī)師孫恒宇根據(jù)人參與山茱萸的傳統(tǒng)功效及臨床治療經(jīng)驗，給出如下方解：人參補氣固本，得山茱萸更增收澀固脫之力，山茱萸雖味酸以固脫見長，但無人參滋補元氣則不能久固。兩者相須配伍，一補一固，則補益之力強而持久，補身體之正，抗化療藥物之偏，具有陰陽氣血雙補之效。結合實驗室前期工作基礎，選擇人參-山茱萸（1∶1）為研究對象，以環(huán)磷酰胺誘導的小鼠骨髓抑制為模型，貞芪扶正顆粒［8-9］為陽性藥，對人參-山茱萸改善骨髓抑制作用及其機制進行初步研究，并對人參-山茱萸配伍后人參中12種人參單體皂苷以及山茱萸中的莫諾苷、馬錢苷進行定量分析。為人參-山茱萸開發(fā)創(chuàng)新藥物提供理論基礎，同時為含有人參-山茱萸復方的進一步研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥材及動物

人參藥材購于吉林省長白縣，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院楊利民教授鑒定為5年生五加科（Araliaceae）人參屬（Panax）植物人參（Panax ginsengC.A.Mey.）的干燥根及根莖。山茱萸藥材（批號01421004，產(chǎn)地河南），來自河北仁心藥業(yè)有限公司，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學中藥材學院楊利民教授鑒定為山茱萸科（Cornaceae）山茱萸屬（Cornus）植物山茱萸（Cornus officinalisSieb.et Zucc.）的干燥成熟果實。

SPF級雄性昆明小鼠（批號：210726210100485436，鼠齡6～8周），體重18～22 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，合格證號：NO.SCXK（遼）2020-0001。

1.2 材料與試劑

對照品：人參單體皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、Rk3、F2、20（S）-Rg3、20（R）-Rg3（吉林大學化學學院），純度＞98%。莫諾苷（批號：Z12O8B45504）、馬錢苷（批號：P30M9F57637）購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%。色譜甲醇、色譜乙腈（美國飛世爾科學世界公司）。環(huán)磷酰胺（德國百特公司）。貞芪扶正顆粒（批號：210111，柳河長隆制藥有限公司）。重組小鼠血小板生成素（批號：0331969-3481）、重組人紅細胞生成素（批號：0331571）、重組小鼠白介素3（批號：0331505）購自近岸蛋白質科技有限公司，重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（批號：0111103，美國派普泰克公司）。細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（批號：011821210512，上海碧云天生物技術有限公司）。小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號：202105）、小鼠血小板生成素（Thrombopoietin，TPO）ELISA試劑盒（批 號：202105）、小鼠紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）ELISA試劑盒（批號：202105）購自江蘇酶免實業(yè)有限公司。

1.3 主要儀器

BSA224S分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］。安捷倫1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）。PE-6800VET全自動動物血細胞分析儀（深圳市普康電子有限公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱（武漢提沃克科技有限公司）。SpectraMax190型酶標儀（美國美谷分子公司）。

1.4 人參-山茱萸提取物的制備

人參、山茱萸藥材按1∶1稱取重量，10倍量水浸泡1 h，回流提取2 h，過濾，濾渣加8倍量水再次回流提取2 h，合并兩次濾液，濃縮，冷凍干燥，研磨搗碎，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 動物分組及給藥

60只小鼠適應性培養(yǎng)7天，隨機分為6組（n=10）：空白組、模型組、陽性藥組、人參-山茱萸（1∶1）低、中、高劑量組。給藥劑量以人體臨床劑量為依據(jù)，成人標準體重按60 kg計，小鼠體重按25 g計，按“體表面積比”換算動物試驗劑量作為臨床等效劑量，陽性藥組給予貞芪扶正顆粒4.5 g/kg（折合成生藥量）。經(jīng)過大量的臨床數(shù)據(jù)分析，認為以人參10 g、山茱萸10 g的劑量治療效果為最佳，人參-山茱萸（1∶1）低、中、高劑量組分別給予1.5、3.0、6.0 g/kg（折合成生藥量），按原生藥材計分別為0.5倍臨床等效劑量、1倍臨床等效劑量、2倍臨床等效劑量。除空白組外，各組小鼠每天腹腔注射環(huán)磷酰胺（80 mg/kg）1次，連續(xù)3天，空白組腹腔注射生理鹽水。第4天開始，空白組和模型組灌胃水，其余組灌胃貞芪扶正顆粒及人參-山茱萸（1∶1）低、中、高，每天1次，連續(xù)12天。

1.6 外周血象、集落刺激因子及骨髓有核細胞數(shù)的測定

給藥完成后，禁食不禁水12 h，采集各組小鼠全血，一部分使用抗凝管收集，對白細胞、血小板進行檢測；另一部分離心收集血清，利用ELISA試劑盒對小鼠血清中的粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、血小板生成素（Thrombopoietin，TPO）、紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）含量進行測定。

取血后處死小鼠，取兩側股骨，剪去兩端，反復沖洗骨髓腔中的骨髓細胞，移液槍反復吹打，制得小鼠骨髓單細胞懸液，離心，吸棄上清加0.5 mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置，離心，吸棄上清后反復清洗2次，重懸細胞，稀釋，對骨髓有核細胞進行計數(shù)。

1.7 造血祖細胞集落的測定

將骨髓單細胞懸液收集在離心管中，按表1于6孔板中對造血祖細胞集落進行培養(yǎng)。紅系集落培養(yǎng)3天，于第4天計數(shù)。粒-單核系集落、巨核系集落、紅系爆式集落培養(yǎng)7天，于第8天計數(shù)。

表1 造血祖細胞培養(yǎng)體系成分組成表Tab.1 Composition of hematopoietic progenitor cell culture system

1.8 骨髓有核細胞周期及凋亡的測定

將骨髓單細胞懸液收集在離心管中，離心，洗滌兩次，然后在4℃下用70%的冷乙醇固定過夜。洗滌兩次，加入10μL碘化丙啶染料溶液，4℃冰箱保存30 min，立即用流式細胞儀測定細胞周期。

將骨髓單細胞懸液收集在離心管中，離心，棄上清，加入500μL結合緩沖液重懸細胞，再加入5 μL異硫氰酸熒光素和10μL碘化丙啶，渦旋混勻，室溫避光孵育，立即用流式細胞儀檢測凋亡細胞，并計算骨髓有核細胞凋亡率。

1.9 人參-山茱萸供試品溶液及對照品溶液的制備

精密稱定“1.4”項下的人參-山茱萸浸膏（取樣量相當于人參原藥材或山茱萸原藥材1 g）放入100 mL錐形瓶中，加甲醇50 mL，記錄其重量，放置過夜，補足重量后30℃超聲1 h，濾過，用移液管移取25 mL濾液于蒸發(fā)皿中，水浴60℃蒸干，甲醇復溶，定容至10 mL容量瓶，搖勻，過0.22μm濾膜進樣。

精密稱取各人參單體皂苷對照品、莫諾苷、馬錢苷適量，甲醇定容，配制成每1 mL含人參皂苷Rg12.0 mg、Re 2.0 mg、Rf 2.0 mg、Rb14.0 mg、Rc 4.0 mg、Rb22.0 mg、Rb32.0 mg、Rd 2.0 mg、Rk32.0 mg、F22.0 mg、20（S）-Rg31.0 mg、20（R）-Rg31.0 mg、莫諾苷4.0 mg、馬錢苷2.0 mg，于4℃儲藏，備用。

1.10 人參-山茱萸色譜條件

人參單體皂苷色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（B）：水（A），梯度洗脫程序如下：0～40 min，18%～21%（B）；40～42 min，21%～26%（B）；42～46 min，26%～32%（B）；46～66 min，32%～33%（B）；66～68 min，33%～34%（B）；68～73 min，34%～38%（B）；73～80 min，38%～49%（B）；80～84 min，49%（B）；84～85 min，49%～51%（B）；85～90 min，51%～60%（B）；90～92 min，60%～65%（B）；92～99 min，65%（B）；99～104 min，65%～85%（B）；104～111 min，85%（B）；111～115 min，85%～18%（B）；115～122 min，18%（B）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫30℃；進樣量10μL；分析時間122 min。

莫諾苷、馬錢苷色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（B）：水（A），梯度洗脫程序如下：0～16 min，10%～55%（B）；16～21 min，55%～10%（B）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長240 nm；柱溫30℃；進樣量10μL；分析時間21 min。

1.11 方法學考察

線性關系考察：將“1.9”項下各對照品溶液配制成A、B、C、D、E五個濃度混合對照品溶液以“1.10”項色譜條件分析。以對照品溶液濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸。

精密度試驗：按照“1.10”項下的色譜條件，取人參單體皂苷和莫諾苷、馬錢苷混合對照品溶液B濃度連續(xù)進樣6次。

穩(wěn)定性試驗：按照“1.10”項下的色譜條件，取人參-山茱萸1：1樣品溶液分別在0、4、8、16、20、24 h時進樣檢測人參單體皂苷穩(wěn)定性。分別在0、2、4、6、8、12 h時進樣檢測莫諾苷及馬錢苷穩(wěn)定性。

重復性試驗：取“1.4”項下的人參-山茱萸（1∶1）浸膏6份，按“1.9”方法制備供試品溶液，按“1.9”項下的色譜條件進行測定。

加樣回收率試驗：取“1.4”項下的人參-山茱萸1：1浸膏6份，分別加入對照品適量，按“1.9”項下的方法制備供試品溶液，按“1.10”項下的色譜條件進行測定。

1.12 人參-山茱萸含量測定

取“1.4”項下的人參-山茱萸（1∶1）浸膏按“1.9”項下的方法制備供試品溶液，再按“1.10”項下的色譜條件進行定量分析，根據(jù)回歸方程，計算人參-山茱萸中12種人參皂苷以及莫諾苷、馬錢苷的含量。

1.13 統(tǒng)計學分析

使用IBM SPSS Statistics 25進行統(tǒng)計學分析，結果以平均數(shù)±標準差（x?±s）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 人參-山茱萸（1∶1）對骨髓抑制小鼠外周血細胞數(shù)及骨髓有核細胞計數(shù)的影響

如圖1所示，與正常小鼠相比，模型組的白細胞、血小板計數(shù)明顯降低（P＜0.01）。陽性藥組和人參-山茱萸（1∶1）各劑量組均能提高小鼠外周血中的白細胞和血小板（P＜0.01）。

如圖1所示。模型組的骨髓有核細胞計數(shù)顯著低于空白組（P＜0.01）。和模型組相比，陽性藥組和人參-山茱萸（1∶1）各劑量組均能增加小鼠骨髓有核細胞（P＜0.01或P＜0.05）；和人參-山茱萸（1∶1）低劑量組相比，中劑量組對骨髓抑制的改善作用優(yōu)于低劑量組（P＜0.05）。

圖1 人參-山茱萸（1∶1）對骨髓抑制小鼠外周血細胞及骨髓有核細胞計數(shù)的影響Fig.1 The effect of Panax ginseng C.A.Mey-Cornus officinalis Sieb.et Zucc（1∶1）on peripheral blood and bone marrow nucleated cells in myelosuppressed mice

2.2 人參-山茱萸（1∶1）對骨髓抑制小鼠血清集落刺激因子的影響

如圖2所示，與正常組相比，模型組GM-CSF，EPO和TPO水平明顯上升（P＜0.01）。陽性藥組和人參-山茱萸（1∶1）各劑量組均能降低GM-CSF，EPO和TPO水平（P＜0.01或P＜0.05），與低劑量組比較，中高劑量組調控GM-CSF和TPO效果更好（P＜0.01或P＜0.05）。

圖2 人參-山茱萸（1∶1）對骨髓抑制小鼠血清集落刺激因子的影響Fig.2 The effect of Panax ginseng C.A.Mey-Cornus officinalis Sieb.et Zucc（1∶1）on colony stimulating factor in myelosuppressed mice

2.3 人參-山茱萸（1∶1）對骨髓抑制小鼠造血祖細胞集落的影響

如圖3所示，與空白組相比，模型組造血祖細胞集落明顯減少（P＜0.01）。和模型組相比，陽性藥組和人參-山茱萸（1∶1）各劑量組造血祖細胞集落數(shù)增加（P＜0.01或P＜0.05）；和人參-山茱萸（1∶1）低劑量組相比，中劑量組對于骨髓造血功能的恢復較好（P＜0.01或P＜0.05）。

圖3 人參-山茱萸1∶1對骨髓抑制小鼠造血祖細胞集落的影響Fig.3 The effects of Panax ginseng C.A.Mey-Cornus officinalis Sieb.et Zucc（1∶1）on hematopoietic progenitor cell colony in myelosuppressed mice

2.4 人參-山茱萸（1∶1）對骨髓抑制小鼠骨髓有核細胞周期的影響

如表2所示，模型組骨髓有核細胞的合成前期明顯高于空白組（P＜0.01），合成期明顯降低（P＜0.01）。和模型組相比，人參-山茱萸（1∶1）各劑量組均能降低合成前期比值（P＜0.01），且中高劑量組可顯著降低合成前期比值（P＜0.01）增高合成期的值（P＜0.01或P＜0.05）

表2 人參-山茱萸（1∶1）對骨髓抑制小鼠骨髓有核細胞周期的影響Tab.2 The effects of Panax ginseng C.A.Mey-Cornus officinalis Sieb.et Zucc（1∶1）on bone marrow nucleated cells cycle in myelosuppressed mice

2.5 人參-山茱萸（1∶1）對骨髓抑制小鼠骨髓有核細胞凋亡的影響

如圖4所示，模型組的凋亡率顯著上升（P＜0.01）。和模型組相比，人參-山茱萸（1∶1）各劑量組均可改善環(huán)磷酰胺所誘導的小鼠骨髓有核細胞凋亡，且中高劑量組對骨髓有核細胞抗凋亡的作用優(yōu)于低劑量組（P＜0.01）。

圖4 人參-山茱萸（1∶1）對骨髓抑制小鼠骨髓有核細胞凋亡的影響Fig.4 The effects of Panax ginseng C.A.Mey-Cornus officinalis Sieb.et Zucc（1∶1）on bone marrow nucleated cells apoptosis in myelosuppressed mice

2.6 方法學考察結果

12種單體人參皂苷和莫諾苷、馬錢苷回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)見表3。

表3 回歸方程、線性范圍和相關系數(shù)Tab.3 Regression equation，linear range and correlation coefficient

12種單體人參皂苷和莫諾苷、馬錢苷的精密度、重復性、穩(wěn)定性的RSD值均小于2%，加樣回收率 平 均 值 為97.61%～102.26%，RSD為0.68%～1.60%。

2.7 含量測定

高效液相色譜圖見圖5，人參-山茱萸（1∶1）中人參皂苷Rg1、Re、Rb3、Rd均無法檢測到，人參皂苷Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rk3、F2、S-Rg3、R-Rg3、莫諾苷以及馬錢苷的含量（mg/g）分別為0.25、0.45、0.51、0.61、0.94、0.84、1.33、1.08、15.28、5.04。

圖5 高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms

3 討論與結論

在化療給藥過程中，骨髓抑制是最常見的副作用之一，因為在抑制或殺死腫瘤細胞同時化療藥物也會對造血干細胞造成損害［10］，而造血干細胞是所有血細胞的來源，因此，外周血細胞的檢測可以間接反映骨髓的造血功能［11］。根據(jù)我們的研究，模型組白細胞、血小板明顯減少，經(jīng)人參-山茱萸（1∶1）給藥后，白細胞和血小板均有改善。如果說外周血可以間接反映骨髓的造血功能，那么骨髓有核細胞的數(shù)量是骨髓損傷更敏感的指標，可以直接反映骨髓的造血功能。本研究中模型組骨髓有核細胞計數(shù)明顯減少，表明環(huán)磷酰胺化療后顯著降低了骨髓有核細胞的數(shù)量，人參-山茱萸（1∶1）給藥后，骨髓有核細胞的數(shù)量增加，其中中劑量改善效果更好。骨髓有核細胞包括粒細胞系、單核細胞系、巨細胞系及淋巴細胞系等，本研究采用造血祖細胞體外半固體瓊脂培養(yǎng)法培養(yǎng)紅系、粒系、巨核系集落，研究結果顯示，環(huán)磷酰胺顯著抑制造血祖細胞集落數(shù)，而人參-山茱萸1∶1可緩解環(huán)磷酰胺對造血祖細胞的抑制作用，促進造血祖細胞的功能的恢復。造血細胞的存活、增殖和分化受基質細胞分泌的細胞因子的調控，在沒有細胞因子的情況下，造血細胞不僅停止增殖，還會發(fā)生凋亡［12］。GM-CSF是一種肽生長因子，在促進造血細胞的增殖和分化以及白細胞的產(chǎn)生中起重要作用［13］。TPO是一種糖蛋白激素，主要功能是刺激造血干細胞分化為巨核細胞，刺激巨核細胞成熟，進一步產(chǎn)生和釋放血小板［14-15］。EPO也是一種對紅系祖細胞有一定特異性的糖蛋白激素，它可以促進骨髓造血細胞的生長和分化［16］。正常情況下，骨髓基質中只有少量細胞因子，經(jīng)過環(huán)磷酰胺造模后，細胞因子含量會應急性增加［17］。本研究中環(huán)磷酰胺增加了血清中集落刺激因子的水平，而人參-山茱萸可顯著降低血清集落刺激因子水平。

骨髓有核細胞數(shù)量的維持取決于骨髓有核細胞中有分裂能力的細胞的增殖、凋亡及其成熟釋放入外周血之間的動態(tài)平衡，化療可引起細胞周期合成前期阻滯，抑制骨髓有核細胞的分裂增殖，而流式細胞儀可以獲取骨髓有核細胞周期中各期所占的比例，有助于對骨髓有核細胞的分裂增殖情況進行分析，研究結果顯示，模型組合成前期比例顯著增加，合成期比例顯著降低，不同劑量人參-山茱萸給藥后，骨髓有核細胞合成前期比例降低，合成期比例增高，表明不同劑量人參-山茱萸均可解除合成前期阻滯，恢復骨髓有核細胞周期。除此之外，化療還可誘導骨髓有核細胞異常凋亡，研究結果顯示，模型組骨髓有核細胞凋亡率顯著升高，而不同劑量人參-山茱萸可顯著降低骨髓有核細胞凋亡率，由此可以看出，人參-山茱萸通過解除骨髓有核細胞周期阻滯，減少骨髓有核細胞凋亡，從而改善環(huán)磷酰胺所誘導的小鼠骨髓抑制。

進一步通過高效液相色譜法對人參配伍山茱萸后人參中12種人參皂苷以及山茱萸中的莫諾苷和馬錢苷的含量進行分析，研究結果顯示，在人參-山茱萸中莫諾苷具有較高的含量（15.28 mg/g），其次為馬錢苷，含量為5.04 mg/g。而常見人參皂苷相比于稀有人參皂苷占比較少，且常見人參皂苷Rg1、Re、Rb3、Rd均無法檢測到，人參皂苷Rk3、S-Rg3、RRg3分別達到0.94 mg/g、1.33 mg/g、1.08 mg/g。初步確認了10種化學成分，為人參-山茱萸的進一步研究提供參考依據(jù)。