梁惠萍 盧庭婷 劉春斌 劉華英 李黎（廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530021）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種常見的功能性胃腸病，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹痛伴有排便頻率和（或）糞便性狀改變［1］。IBS約影響全球9%～23%的人群［2］。課題組曾就廣西南寧市居民IBS的患病情況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，在本地區(qū)IBS的總體患病率為6.53%［3］。IBS大大降低了患者的生活質(zhì)量，甚至限制了他們的工作效率和日常社交活動(dòng)，對(duì)醫(yī)療服務(wù)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)成本的影響巨大［4］。目前IBS的病因及機(jī)制尚未完全明確，心理社會(huì)（壓力、疾病、行為和飲食）和生物（感染、腸道微生物群和免疫激活）變量相互作用與IBS密切相關(guān)［5］。文獻(xiàn)報(bào)道IBS具有家庭聚集現(xiàn)象，且單卵雙胞胎的IBS發(fā)病率高于雙卵雙胞胎，證實(shí)了遺傳因素會(huì)影響IBS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［6］。一項(xiàng)來自瑞典的大型全國性隊(duì)列研究顯示，IBS患者的一級(jí)親屬、二級(jí)親屬及三級(jí)親屬患有IBS的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)呈逐級(jí)遞減趨勢，進(jìn)一步表明基因或共享環(huán)境暴露有助于IBS的發(fā)展，研究者們開始尋找IBS的易感基因［7］。

不同個(gè)體對(duì)疾病易感性的差異在很大程度上由遺傳因素決定。人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與疾病有明確聯(lián)系的遺傳系統(tǒng)，HLA基因已被報(bào)道與很多種疾病相關(guān)聯(lián)［8］。由于HLA基因的多態(tài)性，其可導(dǎo)致抗原結(jié)合凹槽的構(gòu)象與結(jié)合遞呈抗原肽的效率大大不同，使帶有某些特定HLA抗原的個(gè)體易于罹患某一種疾病或?qū)υ摷膊∮休^強(qiáng)的抵抗力。近年來，國內(nèi)外已有學(xué)者對(duì)HLA基因與IBS的相關(guān)性展開了研究，然而，HLA的各種等位基因在不同群體中出現(xiàn)的概率往往相差很大，具有明顯的人種和地區(qū)差異，有可能同一種基因在不同人群、不同區(qū)域的研究中出現(xiàn)不同結(jié)論。因此，在特定區(qū)域檢測相應(yīng)人群，對(duì)了解某種疾病在當(dāng)?shù)厝巳褐械倪z傳易感性具有非常重要的價(jià)值。廣西南寧市是一個(gè)以壯族為主體、多民族聚居的城市，其遺傳背景有別于其他民族和地區(qū)［9］。目前尚未發(fā)現(xiàn)HLA-DQ、HLA-DR基因?qū)V西南寧居民IBS患病影響的研究報(bào)道，本研究采用聚合酶鏈-序列特異性引物方法（polymerase chain reaction-sequence specific primers，PCR-SSP）分別檢測廣西南寧居民IBS患者和健康對(duì)照人群HLA-DQ、HLA-DR等位基因的多態(tài)性，以期從基因?qū)用骊U明HLA基因與廣西南寧居民IBS的關(guān)聯(lián)性，找到疾病易感基因或抵抗基因，為研究IBS的發(fā)生機(jī)制提供新思路。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料選擇居住于南寧市并具有南寧市常住戶口的IBS患者和健康志愿者作為研究對(duì)象。采用IBS RomeⅣ標(biāo)準(zhǔn)——反復(fù)發(fā)作的腹痛，至少1 d/周（最近3個(gè)月內(nèi)發(fā)作），合并以下2條或多條癥狀：①出現(xiàn)與排便有關(guān)的癥狀；②排便頻率發(fā)生改變；③糞便性狀改變。上述癥狀在本次診斷前6個(gè)月出現(xiàn)，最近3個(gè)月的表現(xiàn)符合上述標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：甲狀腺功能低下或亢進(jìn)、慢性胰腺炎等可導(dǎo)致大便次數(shù)和性狀改變的疾??；消化性潰瘍；腹部手術(shù)；進(jìn)展性肝病、腎病或腫瘤等嚴(yán)重疾病患者。IBS患者組：來源于2019年1月至2020年6月期間南寧市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科門診及住院患者，共102例，其中包括以腹瀉為主的IBS（IBS-D）48例、以便秘為主的IBS（IBS-C）13例、混合排便習(xí)慣的IBS（IBS-M）25例和不確定型IBS（IBS-U）16例。入選病例均為初診病例，無合并嚴(yán)重并發(fā)癥等因素?；颊呓M 男 性45例，女 性57例，年 齡18～65歲，平 均（43.94±10.24）歲；健康對(duì)照組為無自身免疫疾病及遺傳性疾病家族史的健康體檢者，共108例，男性47例，女 性61例，年 齡24～67歲，平 均（45.30±12.10）歲，兩組研究對(duì)象性別比例、年齡經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即性別、年齡等在兩組間具有均衡可比性。所有個(gè)體間無任何血緣關(guān)系。采血前已告知研究對(duì)象詳情并征得同意。

1.1.2主要試劑與儀器全血基因組DNA提取試劑盒、HLA基因分型測定試劑盒（天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；超微量紫外分光光度計(jì)（Thermo NanoDrop 2000，Thermo）。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本的采集與處理抽取所有研究對(duì)象晨起空腹靜脈血3 ml，經(jīng)乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝后進(jìn)行分裝（500 μl/管），標(biāo)本采集后立即置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2DNA樣品制備取冷凍的血樣500 μl，使用全血基因組DNA提取試劑盒，按照說明書進(jìn)行DNA提取。超微量紫外分光光度計(jì)檢測DNA的濃度和純度，濃度為12.5～100 ng/μl，A260/A280在1.6～1.9的樣品可用于PCR檢測。

1.2.3HLA-DQ、HLA-DR基因分型檢測采用PCR-SSP方法，試劑盒測定HLA基因分型，按照說明書進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)結(jié)束后，按順序?qū)⒚總€(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物（7 μl）加樣到1.5%的瓊脂糖凝膠孔，150 V電泳15 min。

1.2.4結(jié)果觀察及判讀在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍攝成像，根據(jù)試劑盒說明書中的結(jié)果分型表判讀基因分型情況（圖1、2）。

圖1 HLA-DQ、HLA-DR基因型（雜合子）典型PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoresis of HLA-DQ，HLA-DR allele（heterozygote）

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。HLA-DQ、HLA-DR基因頻率計(jì)算采用直接計(jì)數(shù)法，組間HLA-DQ、HLA-DR基因分型比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)算OR值和95%可信區(qū)間（95%CI）確定HLA-DQ、HLA-DR基因型與IBS發(fā)病的相對(duì)危險(xiǎn)度，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HLA-DQ各等位基因在IBS患者組與健康對(duì)照組中基因頻率的比較兩組各檢出HLA-DQ2、DQ4、DQ5、DQ6、DQ7、DQ8、DQ9共7種等位基因，IBS患者組HLA-DQ6基因表達(dá)頻率高于健康對(duì)照組（P=0.029），而健康對(duì)照組HLA-DQ2基因表達(dá)頻率高于IBS患者組（P=0.014）。其余5種等位基因在兩組間的基因頻率經(jīng)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

2.2HLA-DR各等位基因在IBS患者組與健康對(duì)照組中基因頻率的比較兩組研究對(duì)象檢測出HLADR4、DR7、DR8、DR9、DR11、DR12、DR13、DR14、DR15、DR16、DR17共11個(gè)基因位點(diǎn)，IBS患者組HLA-DR13基因表達(dá)頻率高于健康對(duì)照組（P=0.024）；而HLA-DR17基因表達(dá)頻率低于健康對(duì)照組（P=0.028）。其余等位基因在兩組間的基因頻率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

圖2 HLA-DQ、HLA-DR基因型（純合子）典型PCR電泳圖Fig.2 PCR electrophoresis of HLA-DQ，HLA-DR allele（homozygote）

表2 HLA-DR基因在IBS患者組及健康對(duì)照組中的表達(dá)頻率Tab.2 Expression frequency of HLA-DR gene in IBS patients and healthy controls

3 討論

近年來，國內(nèi)外學(xué)者已對(duì)HLA基因與IBS的相關(guān)性展開研究，但病例的選擇多以IBS-D患者為主。來自美國梅奧診所的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，HLA-DQ2和HLA-DQ8基因均為陽性或HLA-DQ8基因陽性的IBS-D患者較陰性組有更快的小腸傳輸，而HLADQ2、DQ8基因陽性的IBS-D患者結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)低于HLA-DQ2、DQ8基因陰性患者，這種緩慢的結(jié)腸運(yùn)輸可能使IBS-D患者更容易識(shí)別麩質(zhì)（面筋）作為抗原，導(dǎo)致炎癥加?。?0-11］。DOM?A?-MAGROWSKA等［12］對(duì)波蘭48例IBS患者和20例健康對(duì)照者進(jìn)行HLA-DQ2、DQ8基 因 檢 測，發(fā) 現(xiàn)IBS患 者 的HLADQ2或HLA-DQ8基因表達(dá)率為50%（n=24），而健康對(duì)照者HLA-DQ2基因表達(dá)率為20%（n=4），IBS患者HLA-DQ2、DQ8基因表達(dá)率明顯高于健康對(duì)照者。一項(xiàng)針對(duì)60例廣東籍漢族IBS患者的研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1*02或HLA-DQB1*0603等位基因可能是我國廣東籍漢族人群IBS的易感基因［13］。以上研究結(jié)果提示HLA-DQ2基因似乎是IBS的潛在危險(xiǎn)因素，但DIGIACOMO等［14］對(duì)來自意大利南部3個(gè)門診胃腸病學(xué)診所的443例患者進(jìn)行HLA-DQ2、DQ8基因狀態(tài)評(píng)估后卻得到相反的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)36.2%的IBS患者為HLA-DQ2、DQ8基因陽性，但與健康對(duì)照者相比，IBS患者的HLA-DQ2、DQ8基因陽性率較低。丹麥學(xué)者在以人群為基礎(chǔ)的橫斷面研究中，對(duì)2 293例受試者進(jìn)行HLA-DQ2和HLA-DQ8基因篩查，發(fā)現(xiàn)HLA-DQ2、DQ8基因全陰性者IBS患病率為4.6%（55/1 197），而HLA-DQ2或HLA-DQ8基因陽性者IBS患病率僅為2.6%（28/1 086），HLA-DQ2、DQ8基因陽性者IBS的發(fā)生率明顯低于HLA-DQ2、DQ8基因全陰性者，提示攜帶HLA-DQ2、DQ8基因似乎可減少IBS的患病概率，具有保護(hù)作用［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照組HLA-DQ2基因表達(dá)頻率高于IBS患者組。因此，課題組推測HLA-DQ2基因則可能是廣西南寧居民IBS的“保護(hù)”基因型，但未發(fā)現(xiàn)HLA-DQ8基因與IBS的相關(guān)性。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)IBS患者組HLA-DQ6基因表達(dá)頻率高于健康對(duì)照組，與廣東于豐彥等［13］的研究結(jié)論一致，提示HLA-DQ6基因可能既是廣東籍漢族人群IBS的易感基因，也是廣西南寧居民IBS的危險(xiǎn)因素。

由于HLA等位基因具有明顯的人種和地區(qū)差異，同一個(gè)等位基因在一個(gè)種族有某種意義，但在另一個(gè)種族可能就沒有意義或表達(dá)出截然相反的意義［16］。本課題組的研究也提示HLA-DQ基因與IBS的關(guān)聯(lián)在不同國家、地區(qū)及不同人群中存在較大差異。加上IBS的診斷是以癥狀為基礎(chǔ)的，而且癥狀的感知、表達(dá)和解釋受到包括語言在內(nèi)的社會(huì)文化觀點(diǎn)影響，IBS的表現(xiàn)在不同社區(qū)會(huì)有所不同，也會(huì)影響研究樣本的選擇，故類似的研究得出不同的結(jié)論也在情理之中。因此，課題組認(rèn)為在特定區(qū)域?qū)μ囟ㄈ巳哼M(jìn)行檢測，能更好地了解某種疾病在當(dāng)?shù)厝巳褐械倪z傳易感性。

食物對(duì)于IBS的發(fā)生似乎發(fā)揮重要作用，絕大多數(shù)IBS患者報(bào)告癥狀在食物攝入后發(fā)生或在餐后出現(xiàn)癥狀的惡化［17］。食物蛋白經(jīng)腸道酶降解后，被消化的可溶性抗原主要通過腸上皮細(xì)胞吸收，呈遞給T細(xì)胞，誘發(fā)腸道系統(tǒng)的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致對(duì)食物蛋白的特異性耐受或不耐受，對(duì)IBS發(fā)病與否可造成一定影響。HLAⅡ類分子主要參與動(dòng)、植物蛋白、微生物等外源性抗原的加工提呈，HLAⅡ類分子由HLAⅡ類基因編碼，HLA-DR基因與HLA-DQ基因同屬于HLAⅡ類基因，對(duì)機(jī)體的免疫功能狀態(tài)具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。由于目前尚未發(fā)現(xiàn)HLA-DR基因與IBS的相關(guān)性研究報(bào)道，因此，課題組對(duì)兩組研究對(duì)象進(jìn)行HLA-DR基因檢測，并對(duì)兩組間的基因頻率分布進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBS患者組HLADR13基因表達(dá)頻率高于健康對(duì)照組；而HLA-DR17基因表達(dá)頻率低于健康對(duì)照組。提示HLA-DR13基因可能是廣西南寧居民IBS的易感基因，而HLADR17基因可能具有保護(hù)作用。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，課題組發(fā)現(xiàn)在肺移植中，若受試者HLA-DR13基因陽性，其發(fā)生排斥反應(yīng)的概率增高，易發(fā)展為閉塞性細(xì)支氣管炎綜合征（BOS）并導(dǎo)致移植失?。?8］。而如果受試者的HLA-DR17基因有表達(dá)，則可降低BOS的易感性［19］。BOS的發(fā)病與移植后的自身免疫密切相關(guān)，提示攜帶不同HLA-DR基因型的個(gè)體，其免疫狀態(tài)及免疫反應(yīng)強(qiáng)弱有所不同。推測可能是由于HLA-DR13基因可通過某些免疫機(jī)制增強(qiáng)機(jī)體對(duì)食物的敏感性，誘發(fā)腸道系統(tǒng)的免疫反應(yīng)及食物不耐受，從而導(dǎo)致了IBS的發(fā)生，故HLA-DR13基因可能是IBS的危險(xiǎn)因素。而健康對(duì)照組HLA-DR17基因表達(dá)頻率較高，HLA-DR17基因可能是IBS的保護(hù)基因型。其關(guān)聯(lián)機(jī)制可能是HLA-DR17基因本身對(duì)食物中相應(yīng)抗原的遞呈能力較弱，使得機(jī)體對(duì)過敏食物的免疫反應(yīng)水平下降，從而避免了IBS的發(fā)生。

本研究結(jié)果提示，HLA-DQ6、HLA-DR13基因可能是廣西南寧居民IBS的易感基因，而HLA-DQ2、HLA-DR17基因可能為保護(hù)基因型。然而本研究僅限于HLA-DQ和HLA-DR基因，無法完全排除其他HLA等位基因和非HLA基因等混雜因素的干擾，今后還需要開展更多基因型的研究，以完善HLA基因多態(tài)性與IBS遺傳易感性的聯(lián)系。