袁兆林 劉娣 朱緒鋒（滕州市中心人民醫(yī)院檢驗科，滕州 277599）

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，多發(fā)于40～70歲中老年男性，隨著病情發(fā)展患者會出現(xiàn)便秘、便血及局部腹痛等癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中肥大細(xì)胞浸潤情況與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)［1-2］。KOMI等［3］報道，多種腫瘤（尤其是惡性黑色素瘤、乳腺癌和結(jié)直腸癌）中均存在肥大細(xì)胞浸潤，與免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，重塑腫瘤微環(huán)境，釋放促血管生成因子，誘導(dǎo)新生血管形成，并釋放基質(zhì)金屬蛋白酶促進腫瘤侵襲，創(chuàng)造利于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的條件。高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，可與相應(yīng)細(xì)胞表面天然受體結(jié)合，如晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor of advanced glycation end products，RAGE），引起炎癥反應(yīng)［4-5］。QIAN等［6］研究報道，HMGB1/RAGE信號在炎癥驅(qū)動的癌變中起不可或缺作用，HMGB1可促進結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，介導(dǎo)RAGE激活，而RAGE與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。本研究擬構(gòu)建結(jié)直腸癌小鼠模型，探究HMGB1/RAGE軸對結(jié)直腸癌肥大細(xì)胞浸潤的作用及機制，為結(jié)直腸癌治療靶點的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW837（上海ATCC細(xì)胞庫）；雄性BALB/c裸鼠（6～8周齡，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心）；人HMGB1 shRNA和NC shRNA慢病毒表達載體（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)公司）；NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸（PDTC，碧云天生物科技有限公司）；甲苯胺藍(lán)染色液、蘇木素染色液（北京萬佳首化生物科技有限公司）；兔抗小鼠Tryptase抗體、兔抗小鼠HMGB1抗體、兔抗小鼠RAGE抗體、兔抗小鼠NF-κB p65抗體、羊抗兔IgG（HRP）抗體（上海艾博抗貿(mào)易有限公司）；全蛋白提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；小鼠TNF-α測定試劑盒、小鼠IL-1β測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機、-80℃冰箱（美國Thermo公司）；單通道移液器（德國Eppendorf公司）；光學(xué)顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；垂直板電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；酶標(biāo)儀（美國Dynatech Lab公司）。

1.2方法

1.2.1造模與分組無菌條件下于裸鼠腋窩中部外側(cè)皮下注射1×107個SW837細(xì)胞，密切觀察腫瘤生長情況，待腫瘤生長至直徑約1.5 cm時，無菌條件下處死裸鼠，取出腫瘤組織，并將其分切為直徑約2 mm的組織塊，再次接種于裸鼠腋窩中部外側(cè)皮下，待瘤塊生長至直徑4～5 mm時，將裸鼠隨機分為模型組、NC shRNA組、HMGB1 shRNA組和PDTC組，每組8只，另取8只裸鼠接種等體積PBS作為正常對照組。HMGB1 shRNA組每3 d瘤內(nèi)注射1次0.1 ml HMGB1 shRNA慢病毒（滴度為5×108TU/ml），共注射3次［7］；NC shRNA組 每3 d瘤 內(nèi)注射1次0.1 ml NC shRNA慢病毒（滴度為5×108TU/ml），共注射3次；PDTC組每3 d瘤內(nèi)注射1次0.1 ml PDTC（10 μmol/L），共注射3次，正常對照組和模型組每3 d注射1次等體積無菌PBS，共注射3次。

1.2.2觀察腫瘤生長情況對造模成功的裸鼠分組處理后，每2 d進行1次瘤體測量，腫瘤體積=長徑×短徑2/2。

1.2.3甲苯胺藍(lán)染色所有治療結(jié)束后3 d麻醉并處死裸鼠，剝離腫瘤組織，取部分浸于4%多聚甲醛，其余部分經(jīng)液氮凍存后-80℃保存?zhèn)溆谩潭ê玫哪[瘤組織進行脫水并包埋石蠟，切片（5 μm），二甲苯脫蠟，隨后用各級濃度乙醇處理，蒸餾水洗滌，甲苯胺藍(lán)染色，水洗，冰乙酸分化，水洗，冷風(fēng)吹干，二甲苯透明處理，中性樹膠封固，光鏡下觀察肥大細(xì)胞。每片任取10個視野，計算平均值代表該組織中肥大細(xì)胞數(shù)。

1.2.4免疫組化取石蠟切片，按1.2.3進行脫蠟、水化，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶后進行抗原修復(fù)（檸檬酸緩沖液），滴加1∶500稀釋的一抗（兔抗小鼠Tryptase抗體）溶液37℃孵育1 h，洗滌，滴加1∶1 000稀釋的二抗［羊抗兔IgG（HRP）抗體］37℃孵育1 h，洗滌，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶（SP）37℃孵育1 h，洗滌，DAB顯色，顯色終止后蘇木素染液復(fù)染，鹽酸乙醇分化處理，水洗，脫水、透明、中性樹膠封片。光鏡觀察（×400），每片任取10個視野，Image Pro Plus 6.0軟件分析圖像，計算Tryptase陽性表達平均光密度值。

1.2.5Western blot檢測HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白表達取凍存腫瘤組織，剪為組織碎塊，裂解后充分研磨，收集組織液于離心管，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清進行蛋白定量。各組取50 μg蛋白，按1∶4比例加入上樣緩沖液，混勻后沸水浴10 min，上樣凝膠并電泳。結(jié)束后取凝膠進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶室溫封閉1 h，置于1∶1 000稀釋的一抗（兔抗小鼠HMGB1抗體、兔抗小鼠RAGE抗體、兔抗小鼠NF-κB p65抗體）室溫孵育2 h，洗滌，置于1∶2 000稀釋的二抗中室溫孵育1 h，洗滌后顯色，成像系統(tǒng)中拍照，Image J軟件分析結(jié)果。

1.2.6ELISA檢測TNF-α和IL-1β表達研磨腫瘤組織，離心后取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定TNF-α和IL-1β表達。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組腫瘤生長情況隨著腫瘤接種天數(shù)增加，正常對照組無腫瘤生長，模型組和NC shRNA組裸鼠腫瘤體積基本同步增長，HMGB1 shRNA組與PDTC組裸鼠腫瘤體積相較于模型組增長較慢（圖1）。

圖1 各組腫瘤生長情況Fig.1 Tumor growth in each group

2.2各組腫瘤組織中肥大細(xì)胞定量觀察模型組和NC shRNA組腫瘤組織中觀察到浸潤的肥大細(xì)胞被甲苯胺藍(lán)染為深藍(lán)色，胞漿內(nèi)充滿紫色顆粒，細(xì)胞多處于正脫顆粒或已經(jīng)脫顆粒狀態(tài)，細(xì)胞膜凹凸不平，胞漿內(nèi)紫色顆粒外溢，散于細(xì)胞周圍，HMGB1 shRNA組與PDTC組僅見少量肥大細(xì)胞浸潤，且胞漿紫色顆粒較少（圖2）。模型組和NC shRNA組肥大細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HMGB1 shRNA組相較于模型組肥大細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05），HMGB1 shRNA組與PDTC組肥大細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

圖2 腫瘤組織肥大細(xì)胞浸潤情況（TB染色）Fig.2 Infiltration of mast cells in tumor tissues（TB staining）

表1 各組肥大細(xì)胞數(shù)（±s，n=8）Tab.1 Number of mast cells in each group（±s，n=8）

表1 各組肥大細(xì)胞數(shù)（±s，n=8）Tab.1 Number of mast cells in each group（±s，n=8）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

Groups Model NC shRNA HMGB1 shRNA PDTC Number of mast cells 47.58±8.56 44.21±9.82 22.73±5.341）18.25±6.211）

2.3各組腫瘤組織Tryptase水平模型組和NC shRNA組均觀察到大量Tryptase陽性染色顆粒，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HMGB1 shRNA組與PDTC組相較于模型組Tryptase陽性染色顆粒顯著減少（P＜0.05）；HMGB1 shRNA組與PDTC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖3、表2）。

表2 各組腫瘤組織Tryptase蛋白表達（±s，n=8）Tab.2 Expression of Tryptase protein in tumor tissues of each group（±s，n=8）

表2 各組腫瘤組織Tryptase蛋白表達（±s，n=8）Tab.2 Expression of Tryptase protein in tumor tissues of each group（±s，n=8）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

Groups Model NC shRNA HMGB1 shRNA PDTC Tryptase（OD value）2.06±0.27 1.94±0.23 0.62±0.141）0.57±0.121）

圖3 各組腫瘤組織Tryptase蛋白表達（免疫組化）Fig.3 Expression of Tryptase protein in tumor tissues of each group（Immunohistochemistry）

2.4各組腫瘤組織HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白表達模型組和NC shRNA組腫瘤組織HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HMGB1 shRNA組與PDTC組相較于模型組腫瘤組織HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白表達顯著降 低（P＜0.05），HMGB1 shRNA組 與PDTC組HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖4、表3）。

表3 各組腫瘤組織HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白表達（±s，n=8）Tab.3 Expressions of HMGB1，RAGE and NF-κB p65 protein in tumor tissues of each group（±s，n=8）

表3 各組腫瘤組織HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白表達（±s，n=8）Tab.3 Expressions of HMGB1，RAGE and NF-κB p65 protein in tumor tissues of each group（±s，n=8）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

Groups Model NC shRNA HMGB1 shRNA PDTC HMGB1 2.05±0.31 1.97±0.25 1.33±0.161）1.28±0.151）RAGE 1.82±0.34 1.79±0.28 1.15±0.111）1.07±0.101）NF-κB p65 2.33±0.26 2.30±0.21 1.12±0.091）1.05±0.091）

圖4 各組腫瘤組織HMGB1、RAGE、NF-κB p65蛋白表達Fig.4 Expressions of HMGB1，RAGE and NF-κB p65 protein in tumor tissues of each group

2.5各組腫瘤組織TNF-α和IL-1β表達模型組和NC shRNA組腫瘤組織TNF-α和IL-1β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），HMGB1 shRNA組與PDTC組相較于模型組腫瘤組織TNF-α和IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），HMGB1 shRNA組與PDTC組TNF-α和IL-1β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表4）。

表4 各組腫瘤組織TNF-α和IL-1β表達（±s，n=8，pg/ml）Tab.4 Expressions of TNF-α and IL-1β in tumor tissues of each group（±s，n=8，pg/ml）

表4 各組腫瘤組織TNF-α和IL-1β表達（±s，n=8，pg/ml）Tab.4 Expressions of TNF-α and IL-1β in tumor tissues of each group（±s，n=8，pg/ml）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

Groups Model NC shRNA HMGB1 shRNA PDTC TNF-α 423.16±25.85 415.88±24.42 108.73±8.651）105.65±8.231）IL-1β 515.58±37.12 512.86±34.22 94.52±7.461）90.36±7.421）

3 討論

結(jié)直腸癌是一種高發(fā)病率、高致死率的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞是一種重要的腫瘤間質(zhì)組成部分，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起不可或缺的作用［8］。肥大細(xì)胞是一種粒細(xì)胞，廣泛分布于血管附近，顯微鏡下可觀察到染色后的細(xì)胞呈圓形，胞漿中充滿均勻分布于細(xì)胞核周圍的紫色顆粒，這些被染成紫色的分泌顆粒內(nèi)含多種化學(xué)物質(zhì)和細(xì)胞因子，當(dāng)肥大細(xì)胞活化時，以胞吐方式被釋放，發(fā)揮各自生物學(xué)功能［9-10］。XIAO等［11］研究報道，激活肥大細(xì)胞會使其脫顆粒并釋放類胰蛋白酶，激活相應(yīng)信號通路加速血管生成。本研究中，結(jié)直腸癌裸鼠模型腫瘤組織中可觀察到大量正在脫顆?；蛞衙擃w粒的肥大細(xì)胞浸潤，以及大量類胰蛋白酶陽性染色顆粒，表明結(jié)腸癌腫瘤組織存在大量活化的肥大細(xì)胞。ALLER等［12］認(rèn)為，肥大細(xì)胞可調(diào)控炎癥反應(yīng)，創(chuàng)造炎癥間質(zhì)微環(huán)境，使得癌細(xì)胞在機體內(nèi)達到最大生長和入侵水平。HU等［13］報道瘤內(nèi)類胰蛋白酶陽性肥大細(xì)胞浸潤可促進實體瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，與非小細(xì)胞肺癌、肝癌和結(jié)直腸癌五年生存率顯著相關(guān)，顯著降低患者總生存期和無病生存期，導(dǎo)致不良臨床結(jié)果。因此推測減少腫瘤組織中肥大細(xì)胞浸潤可能是抑制結(jié)直腸癌發(fā)展的新思路。

HMGB1是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，可激活免疫細(xì)胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)。多項研究表明，HMGB1與乳腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［14-16］。HUANG等［17］研究報道，下調(diào)HMGB1表達能夠顯著增強化療藥物對結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。HMGB1的超乙?；问娇赏ㄟ^與RAGE結(jié)合調(diào)節(jié)各種促炎細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，RAGE為一種模式識別受體，在眾多疾?。ㄈ绶窝?、糖尿病、阿爾茨海默病、腫瘤等）病理過程中發(fā)揮重要作用［18］。已有報道顯示，HMGB1/RAGE在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，其相互作用導(dǎo)致促炎轉(zhuǎn)錄激活下游因子NF-κB，NF-κB是受RAGE信號調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白［19］。本研究檢測到結(jié)直腸癌組織HMGB1、RAGE和NF-κB蛋白及炎癥因子TNF-α和IL-1β呈高表達，提示結(jié)直腸癌組織中存在炎癥因子及NF-κB激活，而干擾HMGB1表達后，HMGB1 shRNA組與PDTC組RAGE和NF-κB蛋白及TNF-α和IL-1β表達亦顯著下降，表明干擾HMGB1表達可抑制RAGE、NF-κB表達與炎癥因子釋放，與PDTC作用類似。提示抑制HMGB1表達可抑制NF-κB信號通路，抑制炎癥因子分泌。QIAN等［20］研究報道，HMGB1/RAGE對肥大細(xì)胞具有激活作用，阻斷HMGB1/RAGE信號通路可減少海馬區(qū)肥大細(xì)胞浸潤，抑制血腦屏障破壞。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制HMGB1表達或采用NF-κB抑制劑PDTC后，不僅RAGE和NF-κB蛋白表達下調(diào)，腫瘤組織中肥大細(xì)胞浸潤、胞漿紫色顆粒顯著減少，類胰蛋白酶表達也顯著降低，提示抑制HMGB1表達與NF-κB抑制劑PDTC均可抑制結(jié)直腸癌組織肥大細(xì)胞浸潤，進一步證實抑制HMGB1表達可抑制NF-κB信號通路激活。

綜上，HMGB1/RAGE軸可促進結(jié)直腸癌肥大細(xì)胞浸潤，可能通過激活NF-κB信號通路發(fā)揮作用，但仍需進一步驗證。