周超鋒 王賽 田青 高潔瓊 李洪霖 郭志忠

（河南省中醫(yī)院，河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤三區(qū)，鄭州 450000）

食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是最常見的食道癌類型，約占所有病例的90%［1］。由于復(fù)發(fā)、廣泛浸潤和轉(zhuǎn)移，ESCC患者五年總存活率低于13%［2］。盡管包括TP53、PIK3CA、EGFR和KRAS在內(nèi)的多個(gè)基因突變已在ESCC被廣泛報(bào)道，但ESCC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未闡明［3］。早期檢測對提高食管癌患者預(yù)后和降低病死率至關(guān)重要，因此在食管癌中鑒定新的治療靶點(diǎn)和有效診斷標(biāo)志物迫在眉睫。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一系列保守的小非編碼RNA，由20～22個(gè)核苷酸組成，通過與靶mRNA的3'UTR結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解和翻譯抑制，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)［4］。目前證據(jù)表明，miRNA可能嚴(yán)重影響細(xì)胞死亡、分化和轉(zhuǎn)移在內(nèi)的各種生物學(xué)過程。miR-146a、miR-133b、miR-106b-3p、miR-125a、miR-219-5p、miR-206和miR-384等miRNA在ESCC中扮演抑癌因子角色，通過直接靶向癌基因或拮抗促癌信號傳導(dǎo)途徑抑制ESCC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、干細(xì)胞樣干性和免疫逃逸等惡性生物學(xué)行為［5-11］。ZHONG等［12］通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-9-3p在ESCC組織中顯著高表達(dá)，且與ESCC患者預(yù)后相關(guān)。CUI等［13］也表明，ESCC患者血漿中miR-9-3p異常高表達(dá)，是ESCC的獨(dú)立預(yù)后因素，可作為診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。但miR-9-3p對ESCC惡性生物學(xué)行為的作用機(jī)制有待闡明。

本研究擬通過數(shù)據(jù)庫分析，并通過收集ESCC患者組織探討miR-9-3p在ESCC中的表達(dá)差異及其與患者生存的相關(guān)性，此外，通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-9-3p的下游靶標(biāo)，并檢測miR-9-3p對ESCC細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和免疫逃逸的作用機(jī)制，旨在為ESCC診斷和治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床樣本30對確診為ESCC的癌組織及其配對癌旁組織收集于河南省中醫(yī)院（2017年5月至2020年1月）。本研究所有臨床試驗(yàn)均經(jīng)河南省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情同意。miR-9-3p表達(dá)與ESCC患者臨床信息的相關(guān)性見表1。

表1 miR-9-3p表達(dá)與ESCC臨床參數(shù)的相關(guān)性Tab.1 Correlation between miR-9-3p expression and ESCC clinical parameters

1.1.2細(xì)胞株人正常食管上皮細(xì)胞hEEC（貨號：CP-H031）、ESCC細(xì)胞CaEs-17（貨號：CL-0051）、KYSE-30（貨號：CL-0577）、Rca-109（貨號：CL-0077）和TE-1細(xì)胞（貨號：CL-0231）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.3主要試劑miR-9-3p mimic/inhibitor和pcDNA 3.1-IRF2BP2及相應(yīng)陰性對照由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)與合成。青、鏈霉素、DMEM培養(yǎng)基和Lipofectamine2000購自美國賽默飛公司；Trizol、TaqMan miRNA和SYBR Two-Step qRT-PCR Ultra-Mix試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；CCK-8、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室購自美國康寧公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒和報(bào)告基因載體購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；IFN-γ、IL-4和IL-10 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；IRF2BP2和PD-L1免疫印記一抗及二抗購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1數(shù)據(jù)庫分析通過ACLB1數(shù)據(jù)庫（https：//www.aclbi.com）分析miR-9-3p在ESCC中的表達(dá)。通過Starbase數(shù)據(jù)庫（http：//starbase.sysu.edu.cn）［14］分析miR-9-3p表達(dá)與ESCC患者生存率的相關(guān)性，并預(yù)測miR-9-3p的下游靶標(biāo)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染hEEC、CaEs-17、KYSE-30、Rca-109和TE-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液（含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml），37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。KYSE-30細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對照組（NC）、過表達(dá)IRF2BP2組（OV-IRF2BP2）、共過表達(dá)miR-9-3p和IRF2BP2（Co-OV）組，胰 酶 消 化，OV-IRF2BP2和Co-OV組KYSE-30細(xì) 胞 參考Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行pcDNA3.1-IRF2BP2轉(zhuǎn) 染 和miR-9-3p mimic與pcDNA3.1-IRF2BP2共轉(zhuǎn)染。通過Transwell小室將KYSE-30細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)48 h，收集CD8+T細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.3RT-qPCR采用Trizol試劑從收集的組織和所有細(xì)胞系中提取總RNA，采用TaqMan miRNA試劑盒將總RNA中的miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，參考miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒說明書，取2 μl cDNA進(jìn)行miR-9-3p熒光定量分析。PCR反應(yīng)體系共20 μl（2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.4 μl ROX Reference Dye、10 μl SYBR Green Mix、0.8 μl正反向引物和6 μl dH2O）。PCR熱循環(huán)參數(shù)為：94℃變性10 s，60℃退火10 s，75℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)，2-ΔΔCt計(jì)算miR-9-3p相對表達(dá)，并通過U6 snRNA表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。引物序列為miR-9-3p F：5′-GGAGACCGG

AAATGTAGCCA-3′，miR-9-3p R：5′-AATGGCCCGTGGAGTCTTTG-3′；U6 F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4Western blot采用RIPA緩沖液裂解KYSE-30細(xì)胞提取總蛋白，通過Bradford蛋白測定法確定總蛋白濃度。取蛋白樣品在12%SDS-PAGE凝膠上分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶處理，加入特異性抗IRF2BP2（1∶2 000）和PD-L1（1∶1 000）一抗4℃孵育過夜，加入相應(yīng)二抗偶聯(lián)的HRP孵育過夜，暴露于ECL發(fā)光液，并通過iBright智能成像系統(tǒng)觀察和拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5ELISA收集轉(zhuǎn)染后的KYSE-30細(xì)胞并與CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，5 μg/ml LPS處理上清，參考ELISA試劑盒說明書，酶標(biāo)儀檢測CD8+T細(xì)胞上清中IFN-γ、IL-4和IL-10水 平，并 歸 一 化 為pg/ml，計(jì) 算 相 對水平。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)通過Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-9-3p下游靶基因。此處確定為IRF2BP2，并擴(kuò)增IRF2BP2 3'UTR WT和MUT序列。IRF2BP2的WT和MUT序列片段通過限制性內(nèi)切酶載入pmiR-RB-REPORT載體，參考熒光素酶檢測試劑盒說明書檢測T293細(xì)胞熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶相對光單位比值計(jì)算和測量相對熒光素酶活性。

1.2.7CCK-8實(shí)驗(yàn)96孔板中每孔接種1 000個(gè)轉(zhuǎn)染后的KYSE-30細(xì)胞或與轉(zhuǎn)染后的KYSE-30細(xì)胞共培養(yǎng)后的CD8+T細(xì)胞，并在100 μl含10%FBS的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h和96 h，參考CCK-8試劑盒說明書，各孔中加入10 μl CCK-8溶液孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處光密度，測定不同時(shí)間段KYSE-30細(xì)胞增殖情況。

1.2.8Annexin V-FITC/PI實(shí)驗(yàn)收獲轉(zhuǎn)染后的KYSE-30細(xì)胞或與轉(zhuǎn)染后的KYSE-30細(xì)胞共培養(yǎng)后的CD8+T細(xì)胞，PBS洗滌1次，將100 μl細(xì)胞懸液與Annexin V-FITC和PI黑暗中孵育15 min，染色緩沖液洗滌細(xì)胞，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀分析樣品。

1.2.9Transwell實(shí)驗(yàn)將各組轉(zhuǎn)染后的KYSE-30細(xì)胞剝奪血清培養(yǎng)過夜，以1×105個(gè)/孔接種于Transwell小室上室，下室補(bǔ)充含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，12 h后將下室KYSE-30細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置相差顯微鏡隨機(jī)選取5個(gè)不同區(qū)域?qū)w移細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Graphpad 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖形繪制，計(jì)量資料采用±s表示，組間比較采用LSD-t法，三組及以上比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有體外實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1miR-9-3p在ESCC中的表達(dá)ACLBI數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-9-3p在ESCC中呈顯著高表達(dá)（P＜0.01，圖1A）。Starbase數(shù)據(jù)庫分析提示高表達(dá)miR-9-3p的ESCC患者生存較差（P＜0.001，圖1B）。進(jìn)一步檢測ESCC樣本發(fā)現(xiàn)，miR-9-3p在ESCC組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P＜0.001，圖1C）。miR-9-3p表達(dá)與ESCC浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)（表1）。miR-9-3p在ESCC細(xì)胞系中呈顯著高表達(dá)，且在KYSE-30細(xì)胞中表達(dá)最高（P＜0.001，圖1D）。提示miR-9-3p異常表達(dá)可能與ESCC發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。

圖1 miR-9-3p在ESCC中呈異常高表達(dá)Fig.1 miR-9-3p is highly expressed in ESCC

2.2IRF2BP2是miR-9-3p的下游靶標(biāo)進(jìn)一步通過Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-9-3p的下游靶標(biāo)，miR-9-3p與IRF2BP2存在潛在結(jié)合區(qū)域（圖2A）。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，與陰性對照組、IRF2BP2野生型載體共轉(zhuǎn)染組以及miR-9-3p mimic與IRF2BP2突變型載體共轉(zhuǎn)染組相比，miR-9-3p模擬物與IRF2BP2野生型載體共轉(zhuǎn)染組可明顯抑制熒光素酶活性（P＜0.01，圖2B）。外源性調(diào)控KYSE-30細(xì)胞miR-9-3p表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與陰性對照組相比，過表達(dá)miR-9-3p能顯著抑制IRF2BP2表達(dá)（P＜0.01），敲降miR-9-3p則反之（P＜0.01，圖2C）。此外，與正常組織相比，IRF2BP2在ESCC組織中呈顯著低表達(dá)（P＜0.01，圖2D），且其表達(dá)與miR-9-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001，圖2E）。提示miR-9-3p/IRF2BP2對ESCC具有重要調(diào)控作用。

圖2 miR-9-3p靶向負(fù)調(diào)控IRF2BP2表達(dá)Fig.2 miR-9-3p targets and negatively regulates IRF2BP2 expression

2.3miR-9-3p通過IRF2BP2對KYSE-30細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響為驗(yàn)證miR-9-3p/IRF2BP2分子軸對KYSE-30細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，Western blot結(jié)果顯示，過表達(dá)IRF2BP2顯著上調(diào)KYSE-30細(xì)胞IRF2BP2表達(dá)（P＜0.01，圖3A），且Co-OV組與NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。相比于NC組，OV-IRF2BP2組KYSE-30細(xì)胞凋亡水平顯著上調(diào)（P＜0.05，圖3B），且同時(shí)過表達(dá)miR-9-3p和IRF2BP2能夠恢復(fù)KYSE-30細(xì)胞凋亡水平（P＞0.05）。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)OV-IRF2BP2組KYSE-30細(xì)胞增殖和遷移顯著低于NC組（P＜0.01，圖3C、D），而Co-OV組與NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示miR-9-3p通過IRF2BP2促進(jìn)KYSE-30細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。過表達(dá)IRF2BP2能夠下調(diào)KYSE-30細(xì)胞PD-L1表達(dá)（P＜0.001，圖3E），而同時(shí)過表達(dá)miR-9-3p能夠恢復(fù)PD-L1表達(dá)。進(jìn)一步檢測ESCC組織中PD-L1發(fā)現(xiàn)，IRF2BP2表達(dá)與PD-L1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.001，圖3F），且與miR-9-3p呈正相關(guān)（P＜0.001，圖3G）。提示miR-9-3p/IRF2BP2軸可能調(diào)控KYSE-30細(xì)胞PD-L1表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)免疫逃逸。

圖3 miR-9-3p通過IRF2BP2促進(jìn)KYSE-30細(xì)胞惡性生物學(xué)行為Fig.3 miR-9-3p promotes malignant biological behavior of KYSE-30 cells through IRF2BP2

2.4miR-9-3p通過IRF2BP2對KYSE-30細(xì)胞免疫逃逸的影響PD-L1在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中扮演重要角色，因此，共培養(yǎng)KYSE-30細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，探討miR-9-3p/IRF2BP2分子軸對CD8+T細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。CCK-8結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)CD8+T組相比，共培養(yǎng)后CD8+T細(xì)胞增殖活力顯著下調(diào)（P＜0.001），而KYSE-30細(xì)胞 過表 達(dá)IRF2BP2組CD8+T細(xì)胞增殖活力明顯高于NC對照組（P＜0.001），且與過表達(dá)IRF2BP2組相比，同時(shí)過表達(dá)miR-9-3p和IRF2BP2顯著降低CD8+T細(xì)胞增殖（P＜0.001，圖4A）。ELISA結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)CD8+T組相比，共培養(yǎng)能夠抑制CD8+T細(xì)胞IFN-γ和IL-4釋放，且上調(diào)IL-10水平（P＜0.001），與NC組相比，過表達(dá)IRF2BP2組促進(jìn)CD8+T細(xì)胞IFN-γ和IL-4釋放，下調(diào)IL-10水平（P＜0.001），與過表達(dá)IRF2BP2組相比，同時(shí)過表達(dá)miR-9-3p和IRF2BP2則抑制CD8+T細(xì) 胞IFN-γ和IL-4釋 放，且 上 調(diào)IL-10水 平（P＜0.001，圖4B）。Annexin V-FITC/PI結(jié)果顯示，與單獨(dú)培養(yǎng)CD8+T組相比，共培養(yǎng)后CD8+T細(xì)胞凋亡水平顯著上升（P＜0.001，圖4C）。此外，相比于NC組，OV-IRF2BP2能夠阻止KYSE-30細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用（P＜0.05，圖4A）。提示miR-9-3p通過抑制IRF2BP2表達(dá)促進(jìn)KYSE-30細(xì)胞免疫逃逸。

圖4 miR-9-3p通過IRF2BP2促進(jìn)KYSE-30細(xì)胞免疫逃逸Fig.4 miR-9-3p promotes KYSE-30 cells immune escape by targeting IRF2BP2

3 討論

腫瘤發(fā)生涉及多個(gè)致癌基因，腫瘤抑制劑基因和表觀遺傳改變可協(xié)同作用。盡管ESCC已被廣泛研究，但其潛在機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-9-3p在NSCLC癌組織中異常高表達(dá)，且與患者較差預(yù)后顯著相關(guān)。進(jìn)一步生信分析發(fā)現(xiàn)，IRF2BP2是miR-9-3p的下游靶基因。miR-9-3p可通過靶向抑制IRF2BP2表達(dá)促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖、遷移和免疫逃逸并誘導(dǎo)其凋亡。提示miR-9-3p可作為ESCC患者診斷和治療的靶標(biāo)。

本研究部分結(jié)果與ZHONG等［12］和CUI等［13］結(jié)論一致，提示miR-9-3p在ESCC患者診斷和預(yù)后中的重要作用。此外，有研究表明，miR-9-3p在膠質(zhì)瘤中扮演抑癌因子角色，通過靶向FOXG1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖并抑制其凋亡［15］。CAI等［16］也表明，骨髓間充質(zhì)來源外泌體miR-9-3p通過抑制ESM1表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移并誘導(dǎo)其凋亡。TANG等［17］在肝細(xì)胞癌中也確認(rèn)miR-9-3p可作為抑癌因子。與這些研究結(jié)論相反的是，CHEN等［18］發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-9-3p通過靶向BLCAP促進(jìn)髓樣甲狀腺癌細(xì)胞生長并抑制其凋亡。提示miR-9-3p在不同惡性腫瘤中具有雙重作用。本研究中，miR-9-3p作為促癌因子促進(jìn)ESCC發(fā)生發(fā)展。IRF2BP2蛋白被鑒定為與IRF-2相互作用的核蛋白，且是依賴IRF-2的轉(zhuǎn)錄阻遏物。大量研究表明，IRF2BP2在不同生物系統(tǒng)中已成為重要的新轉(zhuǎn)錄輔助因子，可作為基因表達(dá)的正負(fù)調(diào)節(jié)劑［19］。此外，IRF2BP2在包括凋亡、存活和細(xì)胞分化在內(nèi)的不同細(xì)胞功能中起重要調(diào)控作用。研究表明，IRF2BP2在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，且預(yù)示患者生存率較低［20］。肝臟特異性IRF2BP2過表達(dá)抑制Hippo途徑失活導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展［21］。與之相反，本研究中IRF2BP2在ESCC組織中顯著低表達(dá)，且是miR-9-3p的下游靶標(biāo)。過表達(dá)IRF2BP2能抑制ESCC細(xì)胞增殖和遷移并誘導(dǎo)其凋亡。此外，IRF2BP2可能在巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)和淋巴細(xì)胞活化中起作用，突出了其在先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的功能。如IRF2BP2能夠抑制TCR觸發(fā)誘導(dǎo)的幼稚CD4+T細(xì)胞活化和克隆擴(kuò)增［22］。Cdk5缺失會導(dǎo)致IRF2BP2持續(xù)表達(dá)，抑制腫瘤中PD-L1表達(dá)可抑制癌細(xì)胞免疫逃逸［23］。WU等［24］也得到類似的結(jié)果。本研究也發(fā)現(xiàn)，IRF2BP2在ESCC細(xì)胞中可抑制PD-L1表達(dá)，從而緩解ESCC細(xì)胞對CD8+T細(xì)胞增殖的抑制作用和對凋亡的促進(jìn)作用。IFN-γ和IL-4作為腫瘤微環(huán)境中的免疫促進(jìn)因子及IL-10作為免疫抑制因子在癌細(xì)胞免疫逃逸中具有重要調(diào)控作用［25］。本研究表明，過表達(dá)ESCC細(xì)胞IRF2BP2并與CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，CD8+T細(xì)胞上清中IFN-γ和IL-4水平顯著提高，IL-10則反之。提示IRF2BP2能夠抑制ESCC細(xì)胞免疫逃逸。

綜上，本研究提供了有力證據(jù)證明miR-9-3p在ESCC中可作為促癌基因。但無法排除除IRF2BP2外，還有其他可能的miR-9-3p靶標(biāo)有助于ESCC發(fā)生發(fā)展。近年BAIGUDE等［26］描述了一種改進(jìn)的HITS-CLIP和miR-Trap方法，可用于鑒定ESCC細(xì)胞中生物素標(biāo)記的miRNAs靶標(biāo)，可能對miR-9-3p在ESCC進(jìn)展中的作用提供更精確和詳盡的解釋。