張風(fēng) 鄭剛 齊婧 徐佳萌（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，咸陽 712046）

20世紀(jì)60年代初，JENNINGS等［1］首次提出再灌注可能加速壞死缺血期間心肌細(xì)胞不可逆損傷的過程，有爭議者認(rèn)為心肌再灌注只是受到可逆性損傷，或認(rèn)為再灌注可導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡。然而，研究人員通過實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)，再灌注開始時單獨(dú)應(yīng)用治療干預(yù)可縮小梗死面積，心肌缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷被證實(shí)［2-4］。研究發(fā)現(xiàn)，心肌I/R損傷是一種復(fù)雜的病理生理過程，涉及多種信號路徑和因素，與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、能量代謝障礙、細(xì)胞凋亡等關(guān)系密切［5］。

青藤堿（sinomenine，SIN）是從中藥材青風(fēng)藤中提取出的天然生物堿，屬于嗎啡喃家族。臨床多用鹽酸SIN，其具有明顯抗炎、鎮(zhèn)痛、促組胺釋放等多種藥理作用，被廣泛應(yīng)用于各類疾病的治療［6］。已有研究證實(shí)其通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)保護(hù)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷［7］。然而，目前鮮有其對急性心肌I/R損傷作用的研究。鑒于此，本研究制備急性心肌I/R損傷大鼠模型并于造模前14 d給予SIN預(yù)處理，研究SIN對急性心肌I/R損傷大鼠的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料鹽酸青藤堿注射液購自湖南正清制藥集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H43022192；鹽酸維拉帕米注射液購自上海禾豐制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H31021343；10%水合氯醛購自上海尚寶生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）、IL-6、TNF-α、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）的ELISA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；HE染色試劑盒購自北京博奧森科技有限公司；小動物呼吸機(jī)購自浙江大學(xué)醫(yī)療儀器廠，型號：DH-150；切片機(jī)購自北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司，型號：KD2268；正置顯微鏡購自日本尼康，型號：E100；BL-A420型動物心電圖機(jī)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1動物選擇及分組選40只健康成年SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量300～320 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物公司，許可證號：SCXK（川）2015-030。所有大鼠均給予普通飲食適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，手術(shù)前12 h禁食，不禁飲。將40只大鼠按照隨機(jī)分配的原則分為4組（n=10），分別為：Sham組，I/R組，SIN組，VP組。實(shí)驗(yàn)過程中因解剖過程失誤死亡1只，大出血死亡4只，惡性心律失常死亡2只，死亡大鼠按照納入標(biāo)準(zhǔn)及時補(bǔ)充。

1.2.2急性I/R損傷大鼠模型的制備急性I/R損傷模型大鼠制備參照文獻(xiàn)［8］，大鼠稱重后，按3 ml/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛，將麻醉后的大鼠固定于解剖板，四肢皮下組織連接電極，全程記錄心電圖變化。氣管切開，連接呼吸機(jī)，呼吸比為1∶3，呼吸頻率設(shè)定為70次/min，潮氣量6～7 ml/次，開胸暴露心臟，于左心耳下緣2～3 mm處用4-0縫線結(jié)扎左前降支，后構(gòu)建急性I/R損傷模型，Sham組僅分離掛線但不結(jié)扎。以心電圖ST段抬高0.1 mV以上，同時心肌顏色由正常血供時的深紅色變?yōu)槿毖獣r的蒼白色再變?yōu)樵俟嘧⒊晒r的暗紅色作為造模成功的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)過程按照動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)處置動物。實(shí)驗(yàn)原則不可變，為保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)計劃可根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整，死亡動物嚴(yán)格按照各組實(shí)驗(yàn)對象的要求及時補(bǔ)充、飼養(yǎng)、處理，確保每組有效實(shí)驗(yàn)對象的數(shù)量相等，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更充分。

1.2.3各組動物處理方法Sham組：只掛線不結(jié)扎，持續(xù)150 min；I/R組：結(jié)扎30 min，再灌注2 h；SIN組：造模前14 d開始給予SIN［75 mg/（kg·d）］（根據(jù)本課題組前期動物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果［9］及“實(shí)驗(yàn)動物與人體體表面積等效換算比例”計算出大鼠SIN最佳劑量約為75 mg/kg），進(jìn)行灌胃處理；VP組：造模前14 d，給予VP 0.5 mg/kg，用0.9%氯化鈉溶液稀釋，按照1 mg/（kg·d）給予，連續(xù)灌胃14 d［10］。各組大鼠全程記錄心電圖變化，再灌注末抽取動脈血，離心取血清測定LDH、CK-MB、NT-proBNP、SOD、CAT、MDA、TNF-α、IL-6含量。HE染色法觀察心肌組織病理學(xué)變化。

1.2.4觀察指標(biāo)

1.2.4.1監(jiān)測心電圖ST段變化觀察并記錄再灌注2 h末各組大鼠心電圖ST段高度。

1.2.4.2ELISA檢測血清LDH、CK-MB、NT-proBNP、SOD、CAT、MDA、TNF-α、IL-6含量大鼠再灌注2 h后，取腹主動脈血，低溫高速（4℃，4 000 r/min）離心10 min，取上清液，超低溫（-80℃）保存。血清備好后，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明操作，測定血清

LDH、CK-MB、NT-proBNP、SOD、CAT、MDA、TNF-α、IL-6含量。

1.2.4.3心肌組織病理學(xué)檢查各組大鼠分別隨機(jī)取3只，麻醉大鼠后開胸取心臟，固定于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)石蠟包埋、切片（2 μm）、脫蠟等一系列處理后，行常規(guī)HE染色，封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素AVONA方差分析，多組與某一組比較采用最小顯著差數(shù)法（LSD法），多組之間比較采用SNK法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SIN對急性心肌I/R損傷大鼠心電圖ST段的影響與Sham組比較，I/R組大鼠心電圖ST段明顯抬高（P＜0.01）；與I/R組比較，SIN組和VP組能抑制急性心肌I/R損傷大鼠心電圖ST段抬高（P＜0.05）；與VP組比較，SIN組ST段高度下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠心電圖監(jiān)測結(jié)果Fig.1 ECG results of rats in each group

2.2SIN對急性心肌I/R損傷大鼠心肌酶的影響與Sham組比較，I/R組、SIN組、VP組LDH和CK-MB活性均升高（P＜0.01）；與I/R組比較，SIN組和VP組LDH和CK-MB活性均降低（P＜0.01）；與VP組比較，SIN組LDH和CK-MB活性均降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌酶測定結(jié)果（±s）Tab.1 Results of myocardial enzyme determination of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠心肌酶測定結(jié)果（±s）Tab.1 Results of myocardial enzyme determination of rats in each group（±s）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.01；compared with I/R group，2）P＜0.01；compared with VP group，3）P＜0.05.

Groups Sham I/R VP SIN LDH/（U·L-1）268.50±52.18 761.00±83.531）592.00±48.201）2）532.00±41.381）2）3）CK-MB/（U·L-1）15.30±1.98 44.28±5.261）34.19±5.041）2）29.26±4.181）2）3）

2.3SIN對急性心肌I/R損傷大鼠血清NT-proBNP的影響與Sham組比較，I/R組、SIN組、VP組大鼠NT-proBNP均升高（P＜0.01）；與I/R組比較，SIN組和VP組NT-proBNP均降低（P＜0.01）；與VP組比較，SIN組NT-proBNP降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠NT-proBNP測定結(jié)果（±s）Tab.2 NT-proBNP measurement results of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠NT-proBNP測定結(jié)果（±s）Tab.2 NT-proBNP measurement results of rats in each group（±s）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.01；compared with I/R group 2）P＜0.01；compared with VP group，3）P＜0.05.，

Groups Sham I/R VP SIN NT-proBNP/（pg·ml-1）230.72±26.68 580.97±59.101）423.97±33.881）2）374.84±38.001）2）3）

2.4SIN對急性心肌I/R損傷大鼠氧化應(yīng)激的影響與Sham組比較，I/R組、SIN組、VP組大鼠SOD、CAT均降低（P＜0.01），MDA升高（P＜0.01）；與I/R組比較，SIN組SOD、CAT均升高（P＜0.01），MDA降低（P＜0.01），VP組SOD升高（P＜0.01），CAT升高（P＜0.01），MDA降低（P＜0.01）；與VP組比較，SIN組SOD升高（P＜0.05），CAT升高（P＜0.05），MDA降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)測定結(jié)果（±s）Tab.3 Measurement results of oxidative stress indexes of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)測定結(jié)果（±s）Tab.3 Measurement results of oxidative stress indexes of rats in each group（±s）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.01；compared with I/R group，2）P＜0.05，3）P＜0.01；compared with VP group，4）P＜0.05，5）P＜0.01.

Groups Sham I/R VP SIN 78.71±5.65 45.41±4.191）51.11±4.951）2）67.01±4.351）3）5）4.75±0.49 3.01±0.241）3.95±0.351）3）4.29±0.291）3）4）2.89±0.31 7.61±0.601）6.23±0.771）3）5.29±0.451）3）5）SOD/（U·mg-1）CAT/（U·mg-1）MDA/（nmol·mg-1）

2.5SIN對急性心肌I/R損傷大鼠炎癥因子的影響與Sham組比較，I/R組、SIN組、VP組大鼠TNF-α、IL-6均升高（P＜0.01）；與I/R組比較，SIN組、VP組TNF-α、IL-6均降低（P＜0.01）；與VP組比較，SIN組TNF-α降低（P＜0.01）、IL-6降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠炎癥因子測定結(jié)果（±s）Tab.4 Measurement results of inflammatory factors in each group（±s）

表4 各組大鼠炎癥因子測定結(jié)果（±s）Tab.4 Measurement results of inflammatory factors in each group（±s）

Note：Compared with Sham group，1）P＜0.01；compared with I/R group，2）P＜0.01；compared with VP group，3）P＜0.05，4）P＜0.01.

Groups Sham I/R VP SIN TNF-α/（ng·L-1）26.94±3.36 107.52±5.621）95.16±6.221）2）74.90±6.161）2）4）IL-6/（ng·L-1）46.75±6.07 131.47±6.011）106.85±5.811）2）99.58±7.741）2）3）

2.6SIN對急性心肌I/R損傷大鼠心肌組織病變的影響觀察大鼠心肌組HE染色結(jié)果，Sham組大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、排列整齊，未見炎癥細(xì)胞浸潤；I/R組大鼠心肌結(jié)構(gòu)呈不同程度損傷，主要為心肌纖維斷裂、排列紊亂、細(xì)胞腫脹、間隙變寬、炎癥細(xì)胞浸潤等病理性改變；SIN組或VP組心肌形態(tài)和結(jié)構(gòu)較模型組整齊、清楚，細(xì)胞腫脹、炎癥細(xì)胞浸潤均得到明顯改善，能抑制急性心肌I/R損傷大鼠心肌組織病理性改變，其中SIN組效果更為顯著。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果（×20）Fig.2 Results of myocardial histopathological examination of rats in each group（×20）

3 討論

在過去20年，ST段抬高型心肌梗死的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國家中有所下降，而發(fā)展中國家急性心肌梗死的發(fā)病率仍在持續(xù)上升［11］。急性心肌梗死治療的目的是迅速開通閉塞的冠脈，改善心肌供血供氧，挽救瀕死心肌細(xì)胞，縮小心肌細(xì)胞死亡的面積，保留左心室泵血功能，預(yù)防心力衰竭。再灌注是臨床上治療急性心肌梗死的首選方案，采用直接經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PPCI）。然而，盡管PPCI治療及時、有效地進(jìn)行，急性心肌梗死患者的病死人數(shù)和病死率仍然很高，據(jù)報道急性心肌梗死事件1年后，有大約22%患者出現(xiàn)心力衰竭、7%患者病死，急性心肌I/R損傷嚴(yán)重影響心肌梗死患者的預(yù)后，是當(dāng)前臨床中急需解決的難題［12］。

給藥預(yù)處理是臨床上預(yù)防組織器官I/R損傷的常用方案。SIN為我國傳統(tǒng)中草藥青風(fēng)藤的主要活性成分，作為一種具有廣泛藥理活性的單體中成藥，在臨床上有廣泛的開發(fā)應(yīng)用前景。本課題組既往研究發(fā)現(xiàn)，SIN可抑制炎癥反應(yīng)，從而使動脈粥樣硬化進(jìn)程減慢［13］。有研究表明，SIN可減輕阿奇霉素誘導(dǎo)的急性肝損傷大鼠肝臟組織病理性改變［14］。YANG等［15］研究發(fā)現(xiàn)在大腦中動脈閉塞誘導(dǎo)的I/R損傷大鼠中，SIN可使大腦皮層的神經(jīng)元退行性病變減輕。伊?xí)詣偟龋?6］學(xué)者發(fā)現(xiàn)在大鼠大腦中動脈栓塞誘發(fā)的腦缺血損傷中，SIN可通過促進(jìn)大鼠腦細(xì)胞增殖，抑制神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減輕腦損傷。本研究采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎30 min，松開結(jié)扎線復(fù)灌2 h的方法制作大鼠急性心肌I/R損傷的模型，并于造模前14 d給予SIN進(jìn)行預(yù)處理，VP能夠抑制Ca2+內(nèi)流而減輕心肌I/R損傷，是保護(hù)心肌I/R損傷的常用藥物［17-18］。本研究結(jié)果顯示，SIN預(yù)處理能夠有效抑制急性心肌I/R大鼠心電圖ST段抬高、抑制心肌組織結(jié)構(gòu)病理性改變，提示SIN預(yù)處理對急性心肌I/R損傷有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激參與多種病變過程，越來越多的研究表明SIN具有抗氧化應(yīng)激的作用。吳英等［19］發(fā)現(xiàn)SIN可提高神經(jīng)病理性痛大鼠痛閾，與降低脊髓組織促氧化因子MDA水平、升高抗氧化應(yīng)激因子SOD水平有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型中，SIN可升高腦組織中抗氧化酶（GPx、SOD）含量、降低MDA含量［20］。數(shù)據(jù)顯示，在異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌肥厚小鼠中，SIN可明顯升高心肌T-SOD活性、降低心肌MDA水平，增強(qiáng)心肌抗氧化能力［21］。本研究結(jié)果顯示，SIN可降低急性心肌I/R損傷大鼠MDA水平，升高SOD和CAT水平，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對于刺激的一種常見病理反應(yīng)，其貫穿心肌I/R損傷全過程。大量研究表明SIN具有抗炎作用。有文獻(xiàn)報道SIN通過降低組織中IL-1β、TNF-α、IL-17A等促炎細(xì)胞因子水平，增加IL-10抗炎因子的水平，抑制NLRP3炎癥小體，使小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎減輕［22］。ISIK等［23］發(fā)現(xiàn)SIN可降低慢性哮喘小鼠組織中促炎因子IL-4、IL-5和IL-13水平。有研究表明，SIN可顯著降低與應(yīng)激和炎癥相關(guān)因子（p38MAPK、NF-κB、c-fos、p-CAMKⅡ、COX-2、p-CREB、TLR4和IL-17A）在體外培養(yǎng)的大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)［24］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIN能有效降低急性心肌I/R損傷大鼠心肌組織TNF-α、IL-6水平，提示SIN具有抑制急性心肌I/R損傷大鼠心肌組織炎癥級聯(lián)反應(yīng)的作用。

本研究表明，在急性心肌I/R損傷大鼠中，SIN可有效抑制心電圖ST段抬高，抑制心肌細(xì)胞腫脹、炎癥細(xì)胞浸潤等病變，可降低心肌酶LDH和CK-MB水平，降低NT-proBNP水平，降低MDA水平，提高SOD和CAT水平，降低TNF-α和IL-6水平。綜上所述，SIN可減輕心肌I/R引起的損傷，與緩解氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)有關(guān)。下一步計劃研究SIN對藥物損傷等其他因素導(dǎo)致的心肌損傷的影響，為急性心肌損傷的治療提供理論依據(jù)。