李琳娜 李堅 賀熙喬 劉麗麗 張浩強 仲彥霖 宋冰

（錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，錦州 121000）

近年肥胖癥患者逐年增加［1］。肥胖作為2型糖尿病、高脂血癥、高血壓、冠心病、呼吸睡眠暫停及骨關節(jié)炎等多種疾病的獨立危險因素已得到廣泛認可，給患者生活帶來了極大困擾［2］。大量研究顯示其主要病理機制與肥胖誘導的脂質代謝異常及脂肪組織慢性炎癥密切相關。Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）作為TLRs家族重要成員，在機體固有免疫應答中扮演重要角色，參與誘導細胞內信號級聯(lián)反應并調節(jié)炎癥因子釋放。TLR4/MyD88參與一系列組織器官損害（如心功能不全、急性肺部炎癥、慢性肝炎病毒感染）等炎癥反應調節(jié)［3-6］。但有關TLR4在高脂誘導的肥胖小鼠慢性炎癥調節(jié)的研究較少。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）作為重要的細胞代謝感受器，人和動物研究均已證實AMPK不僅參與脂肪組織慢性炎癥、胰島素抵抗調節(jié)，還參與脂肪細胞凋亡調控，后者與脂肪組織炎癥反應密切相關［7-12］。AMPK激活可有效抑制肥胖誘導的脂肪組織慢性炎癥和細胞凋亡?；诖?，本研究旨在探索TLR4基因敲除是否可通過MyD88依賴的AMPK進而緩解高脂誘導肥胖脂肪組織慢性炎癥和細胞凋亡，對臨床發(fā)掘新的抗肥胖藥物具有指導意義。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物4周齡健康雄性C57BL/6J小鼠（SCXK［京］2009-0015，北京華阜康有限公司）和TLR4基因敲除小鼠（022507，美國Jackson實驗室）各24只，體質量（14±2）g。所有小鼠置于錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院SPF級環(huán)境［（22±2）℃，濕度（50±20）%，自由飲水、攝食，12 h晝夜循環(huán)］中飼養(yǎng)。動物實驗操作均按照錦州醫(yī)科大學倫理委員會規(guī)定進行。

1.1.2主要試劑與儀器HE染色試劑盒、兔抗小鼠TLR4、兔抗小鼠MyD88、兔抗小鼠AMPKα和磷酸化p-AMPKα（Thrl72）超敏ECL發(fā)光試劑盒（沈陽萬類科技生物有限公司）；兔抗鼠β-actin（美國Santa cruz）；山羊抗兔HRP二抗、山羊抗小鼠HRP二抗（美國CST）；小鼠MCP-1、IL-6、TNF-α和IL-10 ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物有限公司）；PVDF膜（0.22/0.45 μm，美國Millipore）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Western blot制膠試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；標準蛋白Marker（美國Themo Fisher Scientific）；超純水機（美國Millipore公司）；制冰機（Sanyo公司）；組織勻漿機、超聲波破碎儀（美國Qsonica公司）；高速冷凍離心機（Eppendorf公司）；全自動酶標儀（Tecan公司）；電泳儀、電泳槽（Bio-Rad公司）；脫色搖床STS-3（上海琪特分析儀器有限公司）；BT100-1L蠕動泵（保定蘭格恒流聚有限公司）；凝膠成像儀（Thermo公司）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司）。

1.2方法

1.2.1分組與模型建立4周齡雄性C57BL/6J和TLR4基因敲除小鼠各24只，隨機分為正常對照組（NC，n=8）、肥胖組（OB，n=16）、TLR4基因敲除組（TK，n=8）、TLR4基因敲除肥胖組（TO，n=16）。NC組給予含脂肪10%的全價營養(yǎng)顆粒飼料，其他組給予含脂肪60%的專用高能飼料喂養(yǎng)，16周后成功篩選高脂飲食組體質量大于普通營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)組小鼠體質量上限且未發(fā)生糖尿病的小鼠8只納入肥胖模型，其余剔除。

1.2.2生化指標檢測16周后（各組小鼠術前禁飲食6 h）稱取體質量，斷頭處死，心臟取血，檢測空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）水平。

1.2.3HE染色16周后取各組小鼠附睪周圍脂肪組織，4%多聚甲醛固定，固定效果滿意后進行組織脫水透明、石蠟包埋、切片等處理，按照HE染色試劑盒說明書進行染色，封片晾干，40倍光學顯微鏡下觀察各組脂肪組織脂肪細胞形態(tài)變化。

1.2.4Western blot 16周后斷頭處死小鼠，速取各組小鼠附睪脂肪組織放入事先標記的潔凈EP管，每組選取8份樣本進行稱重（多余的-80℃儲存?zhèn)溆茫?。加入裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），冰上剪碎后4℃靜置30 min，組織超聲（10 s×3次），4℃離心（12 000 r/min，25 min），取中層液體，按BCA蛋白定量試劑盒說明測定各組樣品蛋白濃度，調整終濃度至2 mg/ml，100℃水浴蛋白制樣，15～20 μl/孔上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉至0.45 μm或0.22 μm PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，1×TBST清洗（5 min×3次），加入相應蛋白一抗4℃過夜孵育，次日清洗后加相應辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/鼠二抗室溫孵育2 h，1×TBST清洗（5 min×3次），GISt020凝膠圖像分析儀成像，Image J軟件分析各蛋白與相應β-actin條帶灰度值，計算比值反映各組蛋白表達。

1.2.5ELISA收取各組小鼠血清按相應ELISA試劑盒說明依次檢測單細胞趨化因子-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、IL-6、TNF-α和IL-10表達。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，兩兩比較采 用Turkey檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1TLR4基因敲除降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠體質量建模前各組4周齡小鼠體質量差異無統(tǒng)計學意義，飼養(yǎng)16周后，與NC組相比，OB組小鼠體質量明顯增加（P＜0.01），TK組小鼠體質量明顯降低（P＜0.05）；與OB組相比，TO組小鼠體質量明顯降低（P＜0.01，圖1）。

圖1 各組小鼠體質量比較Fig.1 Comparison of body weight among different groups in mice

2.2TLR4基因改善高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂代謝紊亂16周后，NC組相比，OB組小鼠血清FPG、TC、TG、LDL和FFA水平明顯升高（P＜0.01），HDL水平明顯降低（P＜0.01），TLR4基因敲除組FPG、TC、TG、LDL和FFA水平明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），HDL水平明顯升高（P＜0.01）；與OB組相比，TK組和TO組小鼠血清FPG、TC、TG、LDL和FFA水平明顯降低（P＜0.01），HDL水平明顯升高（P＜0.01，P＜0.05，表1）。

表1 各組小鼠16周后血生化指標比較（±s，n=8）Tab.1 Comparison of blood biochemical indexes among different groups after 16 weeks in mice（±s，n=8）

表1 各組小鼠16周后血生化指標比較（±s，n=8）Tab.1 Comparison of blood biochemical indexes among different groups after 16 weeks in mice（±s，n=8）

Note：Compared with NC group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with OB group，3）P＜0.05，4）P＜0.01；compared with TK group，5）P＜0.05，6）P＜0.01.

Groups NC OB TK TO FPG/（mmol·L-1）6.62±0.33 9.49±0.372）5.60±0.311）4）6.59±0.351）3）TC/（mmol·L-1）0.23±0.01 0.37±0.022）0.07±0.012）4）0.12±0.012）4）5）TG/（mmol·L-1）2.64±0.02 2.96±0.062）2.28±0.032）4）2.33±0.042）4）LDL/（mmol·L-1）1.41±0.02 1.63±0.032）1.15±0.032）4）1.24±0.042）4）5）HDL/（mmol·L-1）1.17±0.02 1.04±0.022）1.30±0.032）4）1.13±0.033）6）FFA/（mEq·L-1）662.44±22.44 1118.14±25.092）540.18±20.412）4）578.09±24.051）4）

2.3TLR4基因敲除緩解高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪細胞變大16周后，HE染色結果顯示，NC組小鼠脂肪細胞排列緊密，細胞大小、形態(tài)較均一，呈多邊形或圓形。與NC組相比，OB和TO組小鼠脂肪細胞明顯增大，形態(tài)不規(guī)則，呈大空泡狀，細胞壁變薄，細胞間隙明顯增寬，提示高脂飲食可誘導小鼠脂肪細胞肥大；與OB組相比，TK組和TO組小鼠脂肪細胞明顯減小，細胞間隙變窄（圖2）。

圖2 各組小鼠16周后附睪脂肪組織形態(tài)變化（HE染色，×400）Fig.2 Morphological changes of epididymal adipose tissue among different groups after 16 weeks in mice（HE staining，×400）

2.4TLR4基因敲除降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪組織TLR4、MyD88表達，增加p-AMPKα蛋白表達16周后，Western blot結果顯示，各組總AMPKα表達差異無統(tǒng)計學意義，與NC組相比，OB組小鼠脂肪 組織TLR4、MyD88表達明 顯增 加（P＜0.01），p-AMPKα蛋白表達明顯減少（P＜0.05）。TK組小鼠MyD88蛋白明顯減少（P＜0.01），p-AMPKα蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與OB組相比，TO組小鼠脂肪組 織TLR4、MyD88表 達 明 顯 減 少（P＜0.01），p-AMPKα表達明顯增加（P＜0.05，圖3）。

圖3 各 組 小 鼠16周 后TLR4、MyD88、p-AMPKα和AMPKα蛋白表達Fig.3 Expressions of TLR4，MyD88，p-AMPKα and AMPKα among different groups after 16 weeks in mice

2.5TLR4基因敲除緩解高脂飲食誘導的肥胖小鼠慢性炎癥反應16周后，NC組相比，OB組小鼠血清MCP-1、IL-6和TNF-α表達明顯上升（P＜0.01），IL-10表達明顯降低（P＜0.05），TK組小鼠血清MCP-1、IL-6和TNF-α水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），IL-10表達明顯升高（P＜0.01）；與OB組相比，TO組小鼠血清MCP-1、IL-6和TNF-α表達明顯降低（P＜0.01），IL-10表達顯著升高（P＜0.01，圖4）。

圖4 各組小鼠16周后炎癥指標變化Fig.4 Changes of inflammatory indexes among different groups after 16 weeks in mice

2.6TLR4基因敲除降低高脂飲食誘導的肥胖小鼠脂肪細胞凋亡水平16周后，Western blot結果顯示，與NC組相比，OB組小鼠脂肪組織Bax蛋白表達明顯增加（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達明顯降低（P＜0.05），TK組小鼠Bax蛋白明顯減少（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；與OB組相比，TO組小鼠脂肪組織Bax表達明顯減少（P＜0.01），Bcl-2表達明顯增加（P＜0.05，圖5）。

圖5 各組小鼠16周后Bax和Bcl-2蛋白表達Fig.5 Expressions of Bax and Bcl-2 among different groups after 16 weeks in mice

3 討論

肥胖作為高血壓、糖尿病等慢性病的主要危險因素，對社會居民健康狀態(tài)造成嚴重威脅［13-14］。因此深入探索肥胖的可能病理機制對臨床抗肥胖藥物開發(fā)具有現(xiàn)實指導意義。本研究首次證實了TLR4可通過MyD88依賴的AMPK通路調節(jié)高脂誘導的肥胖小鼠脂肪組織慢性炎癥和細胞凋亡。

1993年，HOTAMISLIGIL等［15］首次發(fā)現(xiàn)肥胖動物模型體內脂肪組織TNF-α分泌增加進而將肥胖與炎癥密切相關聯(lián)，近年越來越多有關肥胖的研究均集中在免疫炎癥領域，肥胖作為慢性炎癥性疾病的觀點已得到共識。因此，認識免疫炎癥與代謝的關系可能為臨床治療肥胖提供方向。脂肪組織巨噬細胞（adipose tissue macrophages，ATM）是肥胖動物體內誘導脂肪組織慢性炎癥的最主要炎癥細胞，主要分為促炎經典活化型（M1型）和抗炎替代活化型（M2型）［16］。前者可通過分泌炎癥細胞因子（如IL-6、TNF-α）和趨化因子（如MCP-1）等促進脂肪組織炎癥反應進程，誘導胰島素抵抗，但過表達MCP-1又會促進ATM聚集，刺激M2向M1型轉換，誘導炎癥級聯(lián)放大效應，M2型巨噬細胞可分泌IL-10抑制炎癥反應［17-18］。因此，抑制肥胖機體脂肪組織促炎因子釋放和促進抗炎因子分泌可有效緩解慢性炎癥誘導的機體組織損害，阻礙肥胖導致的一系列慢性病發(fā)生。本研究顯示，相比于正常飼料喂養(yǎng)小鼠，高脂誘導的肥胖小鼠脂肪細胞明顯增大，分泌更多的IL-6、TNF-α和MCP-1等炎癥因子，誘導脂肪組織炎癥反應，進一步證實了肥胖與脂肪組織慢性炎癥的關聯(lián)。

TLR4是一種與免疫或炎癥性疾病關系密切的模式識別受體，主要在淋巴細胞、巨噬細胞、內皮細胞及心肌細胞等細胞中表達。肥胖機體血清FFA明顯增多，F(xiàn)FA可刺激脂肪組織TLR4樣受體進而層層激活下游炎癥因子表達。MyD88是一種髓樣蛋白分子，也是TLRs通路最重要的一種接頭蛋白，除TLR3外，MyD88參與了TLRs家族其他所有成員介導的炎癥信號轉導［19］。激活的TLR4能夠活化下游信號因子MyD88促進炎癥因子釋放，觸發(fā)正向免疫炎癥反應［3-6］，與本研究結果一致。AMPK作為重要的細胞代謝感受器，研究顯示AMPK在肥胖誘導的脂肪組織炎癥中發(fā)揮重要作用，活化后的AMPK可促進M1型巨噬細胞向M2型轉化，減少炎癥因子釋放，促進抗炎因子分泌，進而有效發(fā)揮抗炎效應［7，9-10］。既往研究證實TLR4與AMPK存在一定聯(lián)系，WANG等［20］研究顯示，AMPK作為TLR4的信號下游分子參與2型糖尿病脂質代謝及胰島素抵抗調節(jié)。SORAYA等［21-22］發(fā)現(xiàn)短期和長期二甲雙胍治療可通過有效抑制TLR4/MyD88活性上調磷酸化AMPKα表達進而抑制心肌梗死導致的心功能不全，改善心功能，JING等［23］的體外實驗也證明TLR4/MyD88抑制可緩解硫辛酸誘導的AMPK下調。此外，課題組近期研究也證實TLR4基因敲除可通過激活肥胖小鼠骨骼肌組織AMPK磷酸化減少脂肪酸合成，增強脂肪酸β-氧化，進而影響骨骼肌能量代謝及血脂代謝水平［24］?？梢奣LR4/MyD88抑制可通過正向調控AMPK活性參與炎癥反應調節(jié)。本研究顯示，磷酸化的AMPKα在高脂喂養(yǎng)組小鼠中表達明顯下降，TLR4基因敲除后，磷酸化的AMPKα表達明顯上升，同時伴隨促炎因子MCP-1、IL-6和TNF-α表達明顯減少和抑炎因子IL-10明顯增多，以及促凋亡相關蛋白Bax表達明顯降低?？梢奣LR4/MyD88可通過AMPK蛋白參與高脂誘導的肥胖小鼠慢性炎癥及凋亡水平調控，這一發(fā)現(xiàn)為臨床發(fā)掘有效抗肥胖藥物提供了新思路。但本研究的不足之處在于缺乏體外相關細胞實驗的佐證。因此，課題組后續(xù)將會選擇肥胖模型細胞，借助TLR4基因敲除和轉染等實驗進一步證實。