龔東亮 付文芹（復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院骨科，上海 201799）

股骨頭壞死（femoral head necrosis，F(xiàn)HN）的發(fā)生與軟骨喪失密切相關(guān)，Wnt/β-catenin是一類與胚胎骨骼形成、組織修復(fù)和關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)有關(guān)的經(jīng)典通路，并參與激素誘導(dǎo)的FHN［1］。Wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)多個信號級聯(lián)反應(yīng)，具有促進骨肉瘤細胞增殖、遷移和抑制凋亡的作用，Wnt/β-catenin通路可能通過促進軟骨的再生緩解FHN［2］。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有組織修復(fù)能力，研究證實了由BMSCs分泌的外泌體（exosomes，Exo）具有治療FHN的作用，但其機制仍不清楚［3］。BMSCs具有強大的分泌功能，研究顯示其分泌的Exo可緩解軟骨退變損傷［4］。本文主要分析BMSCs-Exo通過Wnt/β-catenin途徑對FHN大鼠軟骨細胞的遷移、增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料Sprague-Dawley（SD）大鼠由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供［許可證號：SCXK（滬）2012-003］（SPF級，雄性，8～10周齡，270～290 g）。氨基甲酸乙酯（上海清溪化學技術(shù)有限公司，中國）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；FACSCantoⅡ流式細胞儀和染色試劑（BD公司，美國）；RNAspin Mini（GE Healthcare，美國）；Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒（DBI Bioscience公司，德國）；ECL顯色試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；抗體、一抗和山羊抗免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶1 000稀釋，#ab6721）（Abcam公司，美國）；硝酸纖維素膜（EMD Millipore，美國）；顯微鏡（Carl Zeiss公司，德國）；NanoSight NS300粒度儀（馬爾文公司，英國）。

1.2方法

1.2.1BMSCs-Exo的分離和培養(yǎng)根據(jù)參考文獻［5］，通過腹膜內(nèi)注射氨基甲酸乙酯（20%生理鹽水，5 ml/kg）麻醉大鼠。采用滅菌的磷酸緩沖液從大鼠的脛骨和股骨中沖洗出骨髓，通過過濾器過濾并懸浮于DMEM培養(yǎng)基中，補充10%的胎牛血清、10 U/ml的青霉素和100 μg/ml的鏈霉素。隨后將細胞在37℃、含5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)24 h。當細胞達到90%匯合時，胰蛋白酶消化，然后重新鋪板在25 cm2培養(yǎng)瓶中為第0代。本研究使用了第3代BMSCs。

使用50 ml無血清DMEM培養(yǎng)基在燒瓶中培養(yǎng)BMSCs，加入100 μmol/L的H2O2處理24 h，將上清液分別以300 g，10 min、2 000 g，10 min和10 000 g，60 min梯度離心以去除殘留的細胞碎片，以120 000 g梯度在4℃下離心90 min分離外泌體。通過NanoSight NS300粒度儀檢測和觀察分離的外泌體。

1.2.2FHN大鼠軟骨細胞培養(yǎng)、分組和干預(yù)根據(jù)參考文獻［6］，臀肌肉內(nèi)注射地塞米松（20 mg/kg，1次/周），每天在跑步機上強迫跑步60 min（1 km/h，1次/周）。8周后對大鼠進行安樂死解剖驗證FHN的建模結(jié)果。提取軟骨組織，按照參考文獻［6］方法構(gòu)建原代FHN軟骨細胞，培養(yǎng)方法同1.2.1。

將FHN軟骨細胞分為對照組、BMSCs-Exo 50組和BMSCs-Exo 100組，分別在培養(yǎng)基中加入終濃度為0、50和100 μg/ml的BMSCs-Exo培養(yǎng)［7］，48 h后收集細胞進行檢測。

1.2.3檢測方法

1.2.3.1CCK-8檢測增殖將1×105個處理后的細胞（150 μl）接種于96孔板，分別在培養(yǎng)第48 h加入10 μl CCK-8試劑并在37℃下孵育顯色，酶標儀檢測在450 nm下每孔吸光度（OD）值。

1.2.3.2劃痕愈合實驗檢測遷移將培養(yǎng)的單層細胞使用200 μl塑料移液器吸頭做劃痕，在0 h拍照記錄劃痕寬度。然后在無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，計算劃痕前緣遷移距離百分比。

1.2.3.3流式細胞術(shù)檢測凋亡將處理后的細胞以不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，將1×106個細胞先后用預(yù)冷的PBS和5%牛血清白蛋白（BSA）洗滌3次，以2 000 r/min離心收集。向細胞中加入300 μl的5%BSA和700 μl 70%預(yù)冷乙醇，低溫過夜。細胞以2 000 r/min離心5 min收集并使用PBS洗滌。將Molt4細胞與100 μl結(jié)合緩沖液和5 μl的Annexin-V-FITC（20 μg/ml）靜置15 min在黑暗中孵化，然后將150 μl結(jié)合緩沖液和10 μl的PI（50 μg/ml）加入試管中靜置15 min，在黑暗中孵化通過FACSCantoⅡ流式細胞儀測量凋亡率。

1.2.3.4RT-qPCR使用RNAspin Mini試劑盒從細胞中提取RNA，使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件如下：37℃，15 min；98℃，5 min。使用BestarTMqPCR預(yù)混液進行qPCR實驗，條件如下：95℃，2 min；94℃，20 s；58℃，20 s，72℃延伸4 min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(tǒng)進行RT-qPCR分析。采用比較循環(huán)閾值并以GAPDH作為內(nèi)參計算mRNA相對表達水平。

1.2.3.5Western blot細胞研磨后于放射免疫沉淀測定裂解緩沖液中在冰上裂解并收集總蛋白。通過8%SDS-PAGE分離每個樣品中等量（50 μg）的蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2 h封閉非特異性抗原。隨后，將膜與分別與一抗（1∶800）在4℃下孵育過夜，然后將膜與山羊抗免IgG二抗在室溫下孵育1 h。使用化學發(fā)光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度計算蛋白相對于GAPDH的表達量。

1.3統(tǒng)計學處理平行實驗次數(shù)和每項指標檢測次數(shù)均為3。數(shù)據(jù)以±s表示。統(tǒng)計分析使用SPSS19軟件。進行方差分析，兩兩比較使用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1BMSCs對FHN軟骨細胞增殖的影響三組的OD值比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。BMSCs-Exo 50組的OD值顯著高于對照組（P＜0.05），BMSCs-Exo 100組的OD值顯著高于對照組和BMSCs-Exo 50組（P＜0.05），見表1。

表1 BMSCs對FHN軟骨細胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effects of BMSCs on proliferation of FHN chondrocytes（±s）

表1 BMSCs對FHN軟骨細胞增殖的影響（±s）Tab.1 Effects of BMSCs on proliferation of FHN chondrocytes（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with BMSCs-Exo 50 group，2）P＜0.05.

Groups Control BMSCs-Exo 50 BMSCs-Exo 100 OD value 0.66±0.06 0.78±0.071）0.89±0.081）2）

2.2BMSCs對FHN軟骨細胞遷移的影響三組細胞的遷移能力比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。BMSCs-Exo 50組的劃痕前緣遷移距離百分比顯著高于對照組（P＜0.05），BMSCs-Exo 100組的劃痕前緣遷移距離百分比顯著高于對照組和BMSCs-Exo 50組（P＜0.05），見圖1、表2。

表2 BMSCs對FHN軟骨細胞遷移的影響（±s）Tab.2 Effects of BMSCs on migration of FHN chondrocytes（±s）

表2 BMSCs對FHN軟骨細胞遷移的影響（±s）Tab.2 Effects of BMSCs on migration of FHN chondrocytes（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with BMSCs-Exo 50 group，2）P＜0.05.

Groups Control BMSCs-Exo 50 BMSCs-Exo 100 Percentage of migration distance of scratch front edge（%）27.32±0.94 45.59±1.451）61.44±1.761）2）

圖1 劃痕愈合實驗檢測BMSCs對FHN軟骨細胞遷移的影響Fig.1 Scratch healing test to detect effect of BMSCs on migration of FHN chondrocytes

2.3BMSCs對FHN軟骨細胞凋亡的影響三組比較凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。BMSCs-Exo 50組的凋亡率顯著低于對照組（P＜0.05），BMSCs-Exo 100組的凋亡率顯著低于對照組和BMSCs-Exo 50組（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 流式細胞術(shù)檢測BMSCs對FHN軟骨細胞凋亡的影響Fig.2 Flow cytometry to detect effect of BMSCs on apoptosis of FHN chondrocytes

表3 BMSCs對FHN軟骨細胞凋亡的影響（±s）Tab.3 Effects of BMSCs on apoptosis of FHN chondrocytes（±s）

表3 BMSCs對FHN軟骨細胞凋亡的影響（±s）Tab.3 Effects of BMSCs on apoptosis of FHN chondrocytes（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with BMSCs-Exo 100 group，2）P＜0.05.

Groups Control BMSCs-Exo 50 BMSCs-Exo 100 Apoptosis rate（%）6.42±0.65 2.55±0.241）1.03±0.111）2）

2.4BMSCs對FHN軟骨細胞中Wnt和β-catenin mRNA的影響三組FHN軟骨細胞中Wnt和βcatenin mRNA水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），BMSCs-Exo 50組的Wnt和β-catenin mRNA水平顯著高于對照組（P＜0.05），BMSCs-Exo 100組的Wnt和β-catenin mRNA水平顯著高于對照組和BMSCs-Exo 50組（P＜0.05），見表4。

表4 BMSCs對FHN軟骨細胞中Wnt和β-catenin mRNA的影響（±s）Tab.4 Effects of BMSCs on Wnt and β-catenin mRNA in FHN chondrocytes（±s）

表4 BMSCs對FHN軟骨細胞中Wnt和β-catenin mRNA的影響（±s）Tab.4 Effects of BMSCs on Wnt and β-catenin mRNA in FHN chondrocytes（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with BMSCs-Exo 50 group，2）P＜0.05.

Groups Control BMSCs-Exo 50 BMSCs-Exo 100 Wnt mRNA 1.52±0.11 2.47±0.201）3.56±0.311）2）β-catenin mRNA 1.56±0.12 2.50±0.231）3.79±0.351）2）

2.5BMSCs對FHN軟骨中Wnt/β-catenin通路中蛋白表達水平的影響三組FHN軟骨細胞中Wnt和β-catenin蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），BMSCs-Exo 50組的Wnt和β-catenin蛋白水平顯著高于對照組（P＜0.05），BMSCs-Exo 100組的Wnt和β-catenin蛋白水平顯著高于對照組和BMSCs-Exo 50組（P＜0.05），見圖3、表5。

圖3 Western blot檢 測BMSCs對FHN軟 骨 中Wnt/β-catenin通路中蛋白表達水平的影響Fig.3 Western blot detection of effect of BMSCs on protein expression level of Wnt/β-catenin pathway in FHN cartilage

表5 BMSCs對FHN軟骨細胞中Wnt和β-catenin蛋白表達水平的影響（±s）Tab.5 Effects of BMSCs on Wnt and β-catenin protein in FHN chondrocytes（±s）

表5 BMSCs對FHN軟骨細胞中Wnt和β-catenin蛋白表達水平的影響（±s）Tab.5 Effects of BMSCs on Wnt and β-catenin protein in FHN chondrocytes（±s）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with BMSCs-Exo 50 group，2）P＜0.05.

Groups Control BMSCs-Exo 50 BMSCs-Exo 100 Wnt protein 0.87±0.07 1.26±0.101）2.35±0.191）2）β-catenin protein 0.94±0.08 1.40±0.121）2.71±0.241）2）

3 討論

FHN的病理形態(tài)學表現(xiàn)為股骨頭塌陷變形、小梁骨不連續(xù)和軟骨下骨結(jié)構(gòu)破壞，其中軟骨的結(jié)構(gòu)性改變和丟失是導(dǎo)致股骨頭關(guān)節(jié)功能喪失的關(guān)鍵［8］。髖關(guān)節(jié)置換術(shù)是根治乳腺癌的重要手段，然而該方法花費較大且手術(shù)風險較高，且目前尚無緩解FHN進展的特效藥物。尋找有效抑制FHN進展和治療FHN的方法具有重要臨床意義。

BMSCs是源于骨髓的具有自我更新能力的多能細胞群，大量研究表明其具有組織修復(fù)能力，在組織損傷后，BMSCs會募集到病灶處并發(fā)揮增殖、分化和分泌能力［9］。Exo細胞外囊泡的一種，其大小通常在40～200 nm，BMSCs中富含大量微小RNA和蛋白質(zhì)，BMSCs-Exo與細胞融合后會調(diào)節(jié)細胞的和生物學行為［10］。最新研究結(jié)果顯示，BMSCs分泌的Exo能有效緩解骨關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)恢復(fù)關(guān)節(jié)功能［11］。也有研究顯示BMSCs-Exo能夠緩解軟骨損傷［12］。本研究分析不同劑量BMSCs-Exo對FHN來源的大鼠軟骨細胞的影響。結(jié)果顯示BMSCs-Exo能夠劑量依賴性地促進FHN來源的大鼠軟骨細胞增殖和遷移，并抑制其凋亡。軟骨細胞的凋亡和結(jié)構(gòu)性改變會使股骨表面粗糙，從而影響關(guān)節(jié)功能并對患者生活造成嚴重影響，而促進軟骨再生可有效緩解FHN。近年來研究顯示BMSCs-Exo能夠促進骨肉瘤細胞的增殖和遷移［13］。郝海珍等［14］研究顯示BMSCs-Exo能夠緩解缺血再灌注引起的神經(jīng)元凋亡。本研究結(jié)果提示BMSCs-Exo能夠通過抑制軟骨凋亡、促進軟骨細胞增殖和遷移，從而促進軟骨的再生，恢復(fù)股骨功能緩解FHN。

為進一步分析BMSCs-Exo調(diào)控FHN大鼠軟骨細胞的機制，本研究檢測了Wnt/β-catenin通路的蛋白水平。β-catenin是細胞質(zhì)中的多功能蛋白，并且是Wnt信號通路中調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵分子，β-catenin可進入細胞核調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。Wnt/β-catenin途徑在軟骨細胞的形成、分化及細胞外基質(zhì)的代謝過程中起關(guān)鍵作用［15］。此外，Wnt/β-catenin也是促進細胞增殖和遷移、抑制凋亡的關(guān)鍵細胞內(nèi)通路，F(xiàn)HN中Wnt/β-catenin通路被抑制，而恢復(fù)Wnt/β-catenin的表達水平能夠緩解FHN［16］。本研究結(jié)果顯示BMSCs-Exo能夠劑量依賴性地提高FHN大鼠軟骨細胞中Wnt和β-catenin轉(zhuǎn)錄和翻譯的水平。LI等［17］的研究結(jié)果顯示BMSCs-Exo通過提高Wnt/β-catenin通路促進BMSCs的增殖和向軟骨細胞分化。也有研究顯示BMSCs-Exo能夠通過上調(diào)Wnt/β-catenin通路抑制神腎癌細胞凋亡并促進其增殖和遷移［18］。提示BMSCs-Exo可能通過促進Wnt/β-catenin通路中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平促進FHN大鼠軟骨細胞的增殖和侵襲，并抑制凋亡。

綜上所述，BMSCs-Exo可能通過促進Wnt/β-catenin通路促進FHN大鼠軟骨細胞的增殖和侵襲，并抑制凋亡，從而促進軟骨生成治療FHN。但BMSCs-Exo治療FHN的作用仍需要體內(nèi)實驗驗證，且BMSCs-Exo中內(nèi)含物復(fù)雜，關(guān)于相關(guān)分子機制仍需要深入研究。