廖振蓉 申昌梅 余瑛（贛州市腫瘤醫(yī)院，贛州 341000）

卵巢癌是導(dǎo)致女性患者死亡的主要惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性生命健康。由于癥狀隱匿性強(qiáng)、體征出現(xiàn)較晚、早期診斷方法缺乏，卵巢癌初次確診時(shí)間較晚，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移概率較高，且治療后復(fù)發(fā)率也相對(duì)較高，五年生存率往往低于40%［1-3］。然而，當(dāng)前手術(shù)治療和放射治療仍然是卵巢癌最主要的治療手段，短時(shí)間內(nèi)并無新的治療策略或治療藥物［1-3］。導(dǎo)致這種狀況的主要因素是對(duì)卵巢癌發(fā)病及進(jìn)展的深層分子機(jī)制認(rèn)識(shí)太少，因而挖掘卵巢癌的決定性因子并闡明其分子機(jī)制是當(dāng)前及未來較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的重要任務(wù)。

DNA損 傷 應(yīng) 答 反 應(yīng)（DNA damage response，DDR）是維持DNA完整性和穩(wěn)定性的重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞常伴有DDR缺陷，導(dǎo)致基因損傷積累，最終引起腫瘤發(fā)生［4-5］。

本研究主要探討DDR相關(guān)蛋白NEIL3在卵巢癌組織中的表達(dá)與卵巢癌分級(jí)的相關(guān)性，并通過體外實(shí)驗(yàn)觀察NEIL3對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響，同時(shí)驗(yàn)證NEIL3與p53信號(hào)通路在卵巢癌中的作用及機(jī)制，為卵巢癌的早期診斷、預(yù)防、靶向治療及抗腫瘤藥物的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料卵巢癌組織和癌旁組織（距離病灶3 cm范圍）標(biāo)本來源于贛州市腫瘤醫(yī)院病理科2016年8月至2019年9月保存的冰凍組織標(biāo)本，癌組織取自原發(fā)灶，對(duì)應(yīng)的癌組織和癌旁組織均取自同一個(gè)體，臨床信息完整。共38例，患者均知情同意。

卵巢癌細(xì)胞株SKOV-3、人正常卵巢上皮細(xì)胞株IOSE80購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫；RPMI1640、FBS、胰酶（Gibco）；NEIL3-siRNA（蘇州泓迅生物科技有限公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen）；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、CCK-8、DMSO、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）；NEIL3、GAPDH引物（上海捷瑞生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染與基因敲減生物學(xué)網(wǎng)站分析并設(shè)計(jì)靶向人源基因NEIL3的siRNA寡核苷酸，然后以脂質(zhì)體法導(dǎo)入細(xì)胞，siRNA靶向敲減細(xì)胞中NEIL3基因的表達(dá)。胰酶消化，計(jì)數(shù)，將SKOV-3、IOSE80以1×106個(gè)/ml接種于6孔板，無雙抗培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到60%～80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。①陰性對(duì)照：2 μl Lipo/100 μl無血清無雙抗培養(yǎng)基；②2 μg NEIL3-siRNA+8 μl Lipo/100 μl無血清無雙抗培養(yǎng)基；③5 μg NEIL3-siRNA+8 μl Lipo/100 μl無血清無雙抗培養(yǎng)基；④7 μg NEIL3-siRNA+8 μl Lipo/100 μl無血清無雙抗培養(yǎng)基，將混合物加入6孔板，輕搖混勻，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，更換含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞備用。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.2細(xì)胞增殖檢測(cè)（CCK-8法）收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，以3 000個(gè)/孔分別接種于96孔板。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后每孔加入10 μl CCK-8試劑，孵育4 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖能力。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.3細(xì)胞凋亡分析收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，以預(yù)冷PBS重懸后再次離心收集細(xì)胞，然后按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒使用說明書進(jìn)行流式檢測(cè)分析凋亡率。簡(jiǎn)述如下：以100 μl結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μl Annexin V-FITC染料，混勻后避光37℃孵育15 min，再加入400 μl結(jié)合液，混勻后，上機(jī)檢測(cè)凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4Transwell小室實(shí)驗(yàn)胰酶消化轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞以1×104個(gè)/孔分別接種于24孔板中懸掛的濾膜孔徑為8 μm的小室中，下室加入600 μl含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。分別于24 h、48 h、72 h后取出小室，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，棉簽輕拭小室濾膜上層。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個(gè)不同的視野拍照，計(jì)數(shù)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，Trizol裂解細(xì)胞，RNA提取試劑盒提取總RNA。取1 μg總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，1 μg cDNA為模板，20 μl總反應(yīng)體系，95℃5 min，（95℃15 s、60℃1 min）×45個(gè)循環(huán)，72℃延伸。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性分析采用χ2檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，生存曲線采用Kaplan-Meier法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1NEIL3與卵巢癌臨床病理因素具有相關(guān)性qPCR檢測(cè)表明卵巢癌組織中NEIL3 mRNA的表達(dá)量是癌旁組織中的3.58倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1A）。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，NEIL3表達(dá)量與卵巢癌患者的生存期呈負(fù)相關(guān)，NEIL3mRNA表達(dá)量高的卵巢癌患者五年生存率明顯低于NEIL3 mRNA表達(dá)量低的患者（P=0.004，圖1B）。

圖1 NEIL3基因表達(dá)的臨床意義Fig.1 Clinical significance of expression of NEIL3 gene

2.2NEIL3促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)如圖2A，qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3中NEIL3 mRNA表達(dá)比人卵巢表皮細(xì)胞IOSE80提高15倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了NEIL3-siRNA（siNEIL3），并成功敲減NEIL3表達(dá)。如圖2B所示，siNEIL3敲減效率達(dá)到90%。SKOV-3細(xì)胞的增殖能力隨之減弱。如表1，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siNEIL3后第5天，SKOV-3增殖能力減弱34%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在卵巢癌A2780細(xì)胞中，第5天后敲減組比對(duì)照組細(xì)胞增殖能力也顯著降低（P＜0.05）。提示NEIL3促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表1 CCK-8法檢測(cè)敲減NEIL3基因后SKOV-3細(xì)胞的增殖情況Tab.1 Proliferation of SKOV-3 cell after knockdown of NEIL3 gene detected by CCK-8 assay

圖2 敲減NEIL3基因可抑制SKOV-3細(xì)胞增殖Fig.2 Knockdown of NEIL3 gene inhibited proliferation of SKOV-3 cells

2.3敲減NEIL3抑制卵巢癌細(xì)胞遷移Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NEIL3對(duì)SKOV-3細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siNEIL3降低NEIL3表達(dá)后，SKOV-3細(xì)胞穿過Transwell小室濾膜的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞遷移能力較對(duì)照組降低53%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。提示NEIL3對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移具有促進(jìn)作用。

圖3 敲減NEIL3基因抑制SKOV-3細(xì)胞轉(zhuǎn)移Fig.3 Migration of SKOV-3 cell was inhibited by knockdown of NEIL3 gene

2.4敲減NEIL3促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染siNEIL3后SKOV-3細(xì)胞凋亡情況。如圖4所示，敲減NEIL3后SKOV-3細(xì)胞凋亡率接近8%，而對(duì)照組凋亡率不到1%，凋亡率升高近8倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。該數(shù)據(jù)表明NEIL3具有保護(hù)卵巢癌細(xì)胞免受凋亡的作用。

圖4 敲減NEIL3基因誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡Fig.4 Knockdown of NEIL3 gene induced apoptosis of SKOV-3 cell

2.5NEIL3通過p53調(diào)控下游分子表達(dá)qPCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。如圖5所示，p53、p21、Bax及caspase-3基因的mRNA表達(dá)水平顯著提高。NEIL3敲減組較對(duì)照組分別提高6.47、7.33、2.82、5.44倍。相 反，NEIL3敲 減 組 中Bcl-2的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低約80%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示NEIL3可能通過p53調(diào)控卵巢癌細(xì)胞凋亡。

圖5 NEIL3調(diào)控SKOV-3細(xì)胞中p53相關(guān)分子表達(dá)Fig.5 NEIL3 regulated expressions of p53-related molecules in SKOV-3 cell

3 討論

DNA堿基可能受到氧化、烷基化、脫胺和氧化性DNA損傷等許多內(nèi)源性和外源性損傷，DNA堿基損傷誘導(dǎo)包括癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病（如帕金森病和阿爾茨海默?。?、衰老等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。堿基切除修復(fù)（base-excision repair，BER）途徑是主要的DNA修復(fù)途徑之一，DNA糖基酶是BER的關(guān)鍵酶，通過催化改性堿基和糖-磷酸主鏈間的N-糖基鍵的水解來啟動(dòng)修復(fù)［6-9］。迄今為止，四種識(shí)別和切除氧化堿基的哺乳動(dòng)物DNA糖基化酶已被鑒定，分別為：OGG1、NTH1、NEIL1和NEIL2。NEIL3是最近被發(fā)現(xiàn)的第三種哺乳動(dòng)物DNA糖基化 酶，與NEIL1和NEIL2同屬于NEIL家族［10-12］。

NEIL家族是與大腸桿菌DNA糖酵素Fpg和Nei同源的蛋白質(zhì)，NEIL1、NEIL2和NEIL3基因分別位于人類的15號(hào)、8號(hào)和4號(hào)染色體。NEIL3是一個(gè)68 kD的蛋白，其催化區(qū)域包含一個(gè)DNA結(jié)合口袋，能夠?qū)⒈谎趸腄NA堿基從端粒四聚體中切除，從而將ssDNA底物中氧化的DNA損傷產(chǎn)物去除，在細(xì)胞快速分裂中修復(fù)受損的堿基中發(fā)揮重要作用［13-14］。NEIL3在增殖細(xì)胞中表達(dá)，處于S/G2期，已被報(bào)道為細(xì)胞周期調(diào)控基因，是與復(fù)制小體相關(guān)的DNA糖基化酶，提示其在維持復(fù)制叉的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用［15］。人NEIL3在胸腺和睪丸中表達(dá)，而小鼠NEIL3在脾臟、骨髓、胸腺、血細(xì)胞和大腦區(qū)域高表達(dá)［16］。此外，NEIL3也被證明與癌癥的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。NEIL3的異常表達(dá)或突變會(huì)影響DNA復(fù)制效率，增加癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，并影響癌癥的進(jìn)展及治療。在一些轉(zhuǎn)移性癌癥的病例中，NEIL3可能是維持癌細(xì)胞生長(zhǎng)或惡性腫瘤進(jìn)展所必需的。

有研究檢測(cè)18個(gè)不同腫瘤組織和健康組織中hNEIL3 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果表明除睪丸和胰腺外，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的NEIL3水平顯著升高。NEIL3在原發(fā)性惡性黑色素瘤中高表達(dá)，與原發(fā)性惡性黑色素瘤的轉(zhuǎn)移發(fā)展及其患者的高病死率相關(guān)。因此，有研究者認(rèn)為高水平的DNA修復(fù)可能解釋了黑色素瘤對(duì)化療和放療的耐藥性。在包括GBM、LGG、PADC、LUAC、KRCCC和KPCCC等多數(shù)腫瘤中，NEIL3表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。NEIL3高表達(dá)水平與不同類型 癌 癥（GBM、LGG、PADC、LUAC、KRCCC和KPCCC）患者的不良臨床結(jié)果顯著相關(guān)。此外，高NEIL3表達(dá)與三陰性表型（ER陰性、PR陰性、HER2陰性表型）間的相關(guān)性是支持預(yù)后較差的乳腺癌特定亞組的一個(gè)重要特征。相反，在胃癌和結(jié)直腸癌患者中，高NEIL3表達(dá)與更好的癌癥特異性生存有關(guān)。因此，NEIL3可能在不同組織引起的癌癥中發(fā)揮不同作用，NEIL3的上調(diào)可能影響不同類型腫瘤的進(jìn)展［16-17］。

然而，NEIL3在卵巢癌中的作用及其機(jī)制尚不明確。本研究通過檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞及組織標(biāo)本中NEIL3的表達(dá)水平，敲減NEIL3-siRNA在卵巢癌中的表達(dá)，較為系統(tǒng)地研究了NEIL3在卵巢癌中的表達(dá)情況和作用機(jī)制。首先，課題組檢測(cè)到卵巢癌組織中NEIL3 mRNA的表達(dá)量高于癌旁組織，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，NEIL3在卵巢癌組織中的表達(dá)與卵巢癌病理分級(jí)及患者的生存時(shí)間有明顯的相關(guān)性。在高分化的卵巢癌組織中，NEIL3 mRNA的表達(dá)量明顯低于低分化的卵巢癌組織，NEIL3 mRNA表達(dá)量高的卵巢癌患者總生存期明顯低于NEIL3 mRNA表達(dá)量低的卵巢癌患者，提示NEIL3表達(dá)上調(diào)可能參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。通過CCK-8、Transwell小室、流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NEIL3對(duì)卵巢癌細(xì)胞惡性行為的影響，結(jié)果顯示，NEIL3能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制其凋亡。敲減NEIL3后，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞內(nèi)p53、p21、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，p53、p21、Bax mRNA表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示沉默NEIL3可能激活p53依賴的凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。

作為DDR的關(guān)鍵酶，NEIL3高表達(dá)的腫瘤可能具有更大的基因組不穩(wěn)定性，NEIL3的高水平表達(dá)可能促進(jìn)癌癥表型基因組不穩(wěn)定和/或干擾替代DNA修復(fù)，這種特殊的特征可能有助于解釋NEIL3高表達(dá)卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為和癌癥患者的不良預(yù)后。本研究結(jié)果提示NEIL3可以作為一個(gè)潛在的藥物靶點(diǎn)被探索，為卵巢癌的治療策略和患者的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)開發(fā)提供了新思路。