劉景新 陳余興 王貴（海南西部中心醫(yī)院骨科，儋州 571700）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是一種由成骨間充質(zhì)細胞引起的骨骼系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤，多發(fā)于15～19歲的青少年。該疾病發(fā)病率高，預(yù)后差，具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，確診時約有20%的患者發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者生命安全［1-2］。近年來，手術(shù)和化療的改進使得OS患者的五年生存率從不足20%提高至65%～75%，但OS患者一旦出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或者耐藥性，常規(guī)的治療策略很難有效延長患者生存期［3］。因此，臨床亟需探尋新的OS治療策略。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂引起的錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)積聚狀態(tài)，過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會誘導(dǎo)細胞凋亡［4-5］。細胞自噬是細胞進行代謝更新的重要途徑，其與腫瘤的能量代謝、炎癥反應(yīng)、化療耐藥性等密切相關(guān)［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，自噬影響多種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡過程［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬均對腫瘤細胞的生存狀態(tài)有一定影響。

木香烴內(nèi)酯（costunolide，Cos）是一種活性倍半萜內(nèi)酯，來源于云木香、雪蓮花、月桂等多種藥用植物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)活性［9］。FU等［10］研究報道，Cos通過激活ROS/MAPK信號通路對腎細胞癌細胞自噬和凋亡起調(diào)控作用。Cos還可通過激活凋亡和自噬通路抑制卵巢癌OAW42-A多藥耐藥細胞的生長［11］。Cos對多種腫瘤細胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，有望成為新一代抗癌藥物。但關(guān)于Cos在OS中的作用及內(nèi)在分子機制的相關(guān)研究較少。因此，本研究以O(shè)S細胞為研究對象，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的角度探討Cos對OS細胞凋亡的影響及其可能的分子機制，以期為Cos的開發(fā)利用和OS的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料人OS MG63細胞株（上海斯信生物科技有限公司）；Cos（純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司），用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解配制成溶液，保存?zhèn)溆?；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素溶液（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（美國APExBIO公司）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；RIPA細胞裂解液、BCA檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔B淋巴細胞瘤-2（B lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因（Bax）、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白真核生物翻譯起始因子2α（eIF2α）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、自噬蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3B-Ⅱ（microtubule-associated protein light chain 3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ）、Beclin-1、p62、β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）（英國Abcam公司）；ECL化學(xué)發(fā)光顯色液（蘇州新賽美生物科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將解凍、復(fù)蘇的MG63細胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，根據(jù)細胞形態(tài)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖能力消化重懸MG63細胞，取100 μl細胞懸液以5×105個/ml密度接種于96孔板，待細胞貼壁后，用不同濃度（5、10、15、20、25、40 μmol/L）Cos處理細胞24 h、48 h、72 h，同時設(shè)置陰性對照（采用DMSO處理）和空白對照（無細胞），每孔設(shè)置5個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)結(jié)束后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次，每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃避光孵育4 h，采用多功能酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm處的吸光度（OD），計算細胞增殖抑制率，用Logit法計算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。細胞增殖活力（%）=（OD藥物組-OD空白對照）/（OD陰性對照-OD空白對照）×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3劃痕試驗檢測細胞遷移能力調(diào)整MG63細胞密度為5×105個/ml，均勻接種于6孔板，每孔設(shè)5個復(fù)孔，待細胞貼壁生長為適宜密度后，棄去培養(yǎng)液，用高溫滅菌的移液槍頭勻速在6孔板內(nèi)每孔正中間垂直劃線，用滅菌的PBS小心洗去細胞碎片，將培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在0 h于倒置顯微鏡下觀察拍照并做好標(biāo)記，用20 μmol/L濃度的Cos處理細胞，陰性對照采用DMSO處理，培養(yǎng)48 h后，于倒置顯微鏡下觀察拍照并標(biāo)記，計算細胞遷移率，實驗重復(fù)3次。細胞遷移率（%）=（0 h劃痕距離-48 h劃痕距離）/0 h劃痕距離×100%。

1.2.4Transwell小室法測定細胞侵襲能力預(yù)先將稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠工作液加入Transwell小室。室溫放置8 h，固化培養(yǎng)基，接種細胞前對基底膜進行水化。取對數(shù)生長期MG63細胞，以5×105個/ml的細胞密度接種于Transwell小室，每孔加入200 μl細胞懸液，下室加入500 μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個復(fù)孔。用20 μmol/L濃度的Cos處理細胞，陰性對照采用DMSO處理，將Transwell小室置入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，無菌棉簽輕輕擦去上層細胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定，20 min后室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗去染液，自然晾干，倒置顯微鏡下觀察計數(shù)，結(jié)晶紫染色細胞數(shù)即為侵襲細胞數(shù)。細胞侵襲率（%）=藥物組穿膜細胞數(shù)/陰性對照組穿膜細胞數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率將MG63細胞以5×105個/ml的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿，加入3 ml培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，陰性對照組采用DMSO處理，Cos組采用20 μmol/L的Cos處理，每孔設(shè)置5個復(fù)孔。細胞處理48 h后，使用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，PBS洗滌2次，加入100 μl的結(jié)合緩沖液重懸細胞，分別加入Annexin V-FITC與PI熒光染液各5 μl，室溫下避光孵育20 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.2.6Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達水平取對數(shù)生長期MG63細胞，重懸調(diào)整密度為1×107個/ml，于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞貼壁。將細胞分為4組：陰性對照組（DMSO處理），Cos組（20 μmol/L Cos處理），Cos+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑牛磺熊去氧膽酸（tauroursodeoxycholic acid，TUDC）組（20 μmol/L Cos和500 mg/L TUDC處理）或Cos+自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）組（20 μmol/L Cos和3 mmol/L 3-MA處理）。細胞處理48 h后，收集各組細胞，加入RIPA緩沖液裂解細胞，在4℃、12 000 r/min條件下離心15 min，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取等量的蛋白提取液進行SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h，分別加入凋亡蛋白Bcl-2抗體（1∶1 000）、Bax抗體（1∶1 000）、Caspase-3抗體（1∶1 000）、Cleaved Caspase-3抗體（1∶1 000）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白eIF2α抗體（1∶1 000）、CHOP抗體（1∶1 000）、PERK抗體（1∶1 000）、自噬蛋白LC3B-Ⅱ抗體（1∶1 000）、Beclin-1抗體（1∶1 000）、p62抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（H+L）（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次，用ECL發(fā)光液顯影，以β-actin為內(nèi)參，分析各條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS17.0和GraphPad Prism7.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理分析，實驗結(jié)果以±s表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Cos對OS細胞增殖、遷移、侵襲的影響分別使用5、10、15、20、25、40 μmol/L的Cos處理MG36細胞24 h、48 h、72 h，CCK-8試驗結(jié)果顯示，相同作用時間時，隨著Cos濃度的升高，MG36細胞增殖活力逐漸降低（P＜0.05）；相同藥物濃度時，隨著Cos濃度作用時間的延長，MG36細胞增殖活力逐漸降低（P＜0.05）。說明Cos對MG36細胞增殖的抑制作用具有濃度和時間依賴性（圖1A）。因Cos作用24 h時對MG63細胞的增殖抑制效果不明顯，72 h時Cos會過度抑制MG63細胞增殖，而48 h時Cos抑制MG63細胞增殖效果最為有效，故本研究采用48 h作為Cos處理細胞的時間。Cos處理MG36細胞48 h的IC50值為19.21 μmol/L，因此，選取20 μmol/L的Cos用于后續(xù)試驗。劃痕試驗和Transwell小室試驗結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，20 μmol/L Cos處理的MG36細胞遷移、侵襲能力明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1B、C）。

圖1 Cos對OS細胞增殖、遷移、侵襲的影響Fig.1 Effects of Cos on proliferation，migration and invasion of OS cells

2.2Cos對OS細胞凋亡的影響與陰性對照組比較，20 μmol/L Cos干預(yù)MG36細胞48 h后，細胞凋亡率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 Cos對OS細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Cos on OS cell apoptosis

2.3Cos對OS細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的影響與陰性對照組比較，Cos顯著上調(diào)MG36細胞的eIF2α、CHOP、PERK蛋白表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 Cos對OS細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Cos on endoplasmic reticulum stress related protein expression in OS cells

2.4內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與Cos誘導(dǎo)的OS細胞凋亡與陰性對照組比較，Cos組Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Cos組比較，Cos+TUDC組Bcl-2蛋白表 達 水平升 高，Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

圖4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與Cos誘導(dǎo)的OS細胞凋亡Fig.4 Endoplasmic reticulum stress is involved in Cos induced OS cell apoptosis

2.5Cos對OS細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響與陰性對照組比較，Cos顯著上調(diào)MG36細胞的LC3B-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平，下調(diào)p62蛋白表達水平，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

圖5 Cos對OS細胞自噬相關(guān)蛋白表達的影響Fig.5 Effect of Cos on autophagy related protein expression in OS cells

2.6自噬參與Cos誘導(dǎo)的OS細胞凋亡與陰性對照組比較，Cos組Bcl-2蛋白表達水平降低，Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Cos組比較，Cos+3-MA組Bcl-2蛋白表達水 平升高，Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。

圖6 自噬參與Cos誘導(dǎo)的OS細胞凋亡Fig.6 Autophagy is involved in Cos induced apoptosis of OS cells

3 討論

OS是一種高度惡性腫瘤，其典型組織學(xué)特征為重度非典型性和多形性，瘤細胞大小不等，形態(tài)不一，治療難度較大［12］。盡管臨床有手術(shù)、放化療等多種治療方法，但由于OS轉(zhuǎn)移潛能高，預(yù)后差，患者生存率仍較低。積極探索新的、更有效的治療方法，改善OS患者生存率及生活質(zhì)量尤為必要。近年來，中藥抗腫瘤活性的研究成為熱點。Cos是多種藥用植物的主要活性成分，據(jù)報道，Cos具有抑制腫瘤增殖和異種移植瘤生長的效果［13］。PENG等［14］研究報道Cos聯(lián)合去氫木香內(nèi)酯通過c-Myc/p53和AKT/14-3-3途徑誘導(dǎo)細胞周期阻滯和凋亡抑制乳腺癌。WEI等［15］研究表明Cos可誘導(dǎo)H1299肺癌細胞凋亡并抑制其遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，Cos能夠顯著抑制MG36細胞增殖，并且其抑制作用呈濃度和時間依賴性。同時，Cos還可有效降低MG36細胞的遷移、侵襲能力，促進OS細胞凋亡。該結(jié)果與JIN等［16］的研究結(jié)果一致，進一步證實Cos可抑制OS細胞的遷移和侵襲，Cos具有抗OS的作用。

CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡的標(biāo)志性蛋白，PERK是具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)合域和蛋白激酶活性的細胞因子，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激初期，啟動的PERK信號通路中PERK通過發(fā)生自體二聚化活化eIF2α，可促進細胞存活，但持久或過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會活化相關(guān)因子誘發(fā)細胞凋亡，最終促進CHOP的表達［17-18］。細胞凋亡過程中，抗凋亡Bcl-2蛋白、促凋亡Bax蛋白、凋亡核心蛋白Caspase-3以及活化的Cleaved Caspase-3蛋白均會異常表達。LIANG等［19］研究發(fā)現(xiàn)苦參堿通過上調(diào)Bax和Fas/FasL表達及下調(diào)Bcl-2表達誘導(dǎo)人OS細胞凋亡。WANG等［20］發(fā)現(xiàn)Cos通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)肺腺癌細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，Cos可通過上調(diào)MG36細胞的eIF2α、CHOP、PERK蛋白表達水平激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDC可以顯著上調(diào)Cos處理的MG36細胞Bcl-2蛋白表達量，顯著下調(diào)Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達量。該結(jié)果提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進Cos誘導(dǎo)的MG36細胞凋亡。

自噬是細胞自我吞噬的過程，屬于一種降解機制，幫助清除老化、受損的細胞器，維持細胞穩(wěn)態(tài)。大量研究證實，自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其可替代凋亡缺陷細胞抑制腫瘤，同時，誘導(dǎo)細胞自噬也可抑制細胞的抗癌活性［21-22］。LC3是自噬中的關(guān)鍵蛋白，其轉(zhuǎn)化為LC3B-Ⅱ是自噬激活的重要標(biāo)志。Beclin-1是一種抑癌基因，其編碼的蛋白是調(diào)控自噬過程的關(guān)鍵蛋白，可通過參與自噬體的形成調(diào)節(jié)自噬活性。p62是一種泛素結(jié)合蛋白，在自噬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，其水平可間接反映自噬小體清除水平［23］。WANG等［24］報道松屬素通過升高Beclin-1和LC3B-Ⅱ的水平、降低p62表達激活自噬，進而調(diào)控糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，Cos可顯著上調(diào)MG36細胞的LC3B-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達量，下調(diào)p62蛋白表達量。提示Cos激活MG36細胞自噬。為探討Cos處理的OS細胞中自噬對細胞凋亡的影響作用，本研究使用自噬抑制劑3-MA處理MG36細胞，結(jié)果顯示，3-MA顯著上調(diào)Cos處理的MG36細 胞Bcl-2蛋白表達量，下調(diào)Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達量。提示抑制自噬能夠有效減弱Cos誘導(dǎo)的細胞凋亡，自噬參與Cos誘導(dǎo)的MG36細胞凋亡。

綜上所述，Cos能夠抑制OS細胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)OS細胞凋亡。其作用機制可能是通過介導(dǎo)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬方面揭示了Cos抗OS的活性，為探索OS的治療提供了新思路。Cos可能通過其他信號通路發(fā)揮抗OS的作用，后期需要進一步揭示Cos抗OS的分子機制。