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        木香烴內(nèi)酯通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡①

        2022-10-02 11:24:06劉景新陳余興王貴海南西部中心醫(yī)院骨科儋州571700
        中國免疫學(xué)雜志 2022年15期
        關(guān)鍵詞:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)陰性抗體

        劉景新 陳余興 王貴(海南西部中心醫(yī)院骨科,儋州 571700)

        骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是一種由成骨間充質(zhì)細(xì)胞引起的骨骼系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤,多發(fā)于15~19歲的青少年。該疾病發(fā)病率高,預(yù)后差,具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移性,確診時(shí)約有20%的患者發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重威脅患者生命安全[1-2]。近年來,手術(shù)和化療的改進(jìn)使得OS患者的五年生存率從不足20%提高至65%~75%,但OS患者一旦出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或者耐藥性,常規(guī)的治療策略很難有效延長患者生存期[3]。因此,臨床亟需探尋新的OS治療策略。

        內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂引起的錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)積聚狀態(tài),過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-5]。細(xì)胞自噬是細(xì)胞進(jìn)行代謝更新的重要途徑,其與腫瘤的能量代謝、炎癥反應(yīng)、化療耐藥性等密切相關(guān)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn),自噬影響多種抗腫瘤藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程[8]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬均對腫瘤細(xì)胞的生存狀態(tài)有一定影響。

        木香烴內(nèi)酯(costunolide,Cos)是一種活性倍半萜內(nèi)酯,來源于云木香、雪蓮花、月桂等多種藥用植物,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)活性[9]。FU等[10]研究報(bào)道,Cos通過激活ROS/MAPK信號通路對腎細(xì)胞癌細(xì)胞自噬和凋亡起調(diào)控作用。Cos還可通過激活凋亡和自噬通路抑制卵巢癌OAW42-A多藥耐藥細(xì)胞的生長[11]。Cos對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用,有望成為新一代抗癌藥物。但關(guān)于Cos在OS中的作用及內(nèi)在分子機(jī)制的相關(guān)研究較少。因此,本研究以O(shè)S細(xì)胞為研究對象,從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的角度探討Cos對OS細(xì)胞凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制,以期為Cos的開發(fā)利用和OS的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1材料人OS MG63細(xì)胞株(上海斯信生物科技有限公司);Cos(純度≥98%,成都曼斯特生物科技有限公司),用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解配制成溶液,保存?zhèn)溆?;RPMI1640培養(yǎng)基,胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素溶液(美國Gibco公司);CCK-8試劑盒(美國APExBIO公司);膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);RIPA細(xì)胞裂解液、BCA檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);兔B淋巴細(xì)胞瘤-2(B lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2結(jié)合抗凋亡基因(Bax)、Caspase-3、Cleaved Caspase-3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白真核生物翻譯起始因子2α(eIF2α)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)、自噬蛋白微管相關(guān)蛋白輕鏈3B-Ⅱ(microtubule-associated protein light chain 3B-Ⅱ,LC3B-Ⅱ)、Beclin-1、p62、β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)(英國Abcam公司);ECL化學(xué)發(fā)光顯色液(蘇州新賽美生物科技有限公司)。

        1.2方法

        1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將解凍、復(fù)蘇的MG63細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d更換1次培養(yǎng)液,根據(jù)細(xì)胞形態(tài)傳代培養(yǎng),取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力消化重懸MG63細(xì)胞,取100 μl細(xì)胞懸液以5×105個(gè)/ml密度接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,用不同濃度(5、10、15、20、25、40 μmol/L)Cos處理細(xì)胞24 h、48 h、72 h,同時(shí)設(shè)置陰性對照(采用DMSO處理)和空白對照(無細(xì)胞),每孔設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌1次,每孔加入10 μl CCK-8溶液,37℃避光孵育4 h,采用多功能酶標(biāo)儀測定每孔在450 nm處的吸光度(OD),計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,用Logit法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。細(xì)胞增殖活力(%)=(OD藥物組-OD空白對照)/(OD陰性對照-OD空白對照)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.2.3劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力調(diào)整MG63細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml,均勻接種于6孔板,每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔,待細(xì)胞貼壁生長為適宜密度后,棄去培養(yǎng)液,用高溫滅菌的移液槍頭勻速在6孔板內(nèi)每孔正中間垂直劃線,用滅菌的PBS小心洗去細(xì)胞碎片,將培養(yǎng)基更換為無血清的RPMI1640培養(yǎng)基,在0 h于倒置顯微鏡下觀察拍照并做好標(biāo)記,用20 μmol/L濃度的Cos處理細(xì)胞,陰性對照采用DMSO處理,培養(yǎng)48 h后,于倒置顯微鏡下觀察拍照并標(biāo)記,計(jì)算細(xì)胞遷移率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞遷移率(%)=(0 h劃痕距離-48 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

        1.2.4Transwell小室法測定細(xì)胞侵襲能力預(yù)先將稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠工作液加入Transwell小室。室溫放置8 h,固化培養(yǎng)基,接種細(xì)胞前對基底膜進(jìn)行水化。取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞,以5×105個(gè)/ml的細(xì)胞密度接種于Transwell小室,每孔加入200 μl細(xì)胞懸液,下室加入500 μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。用20 μmol/L濃度的Cos處理細(xì)胞,陰性對照采用DMSO處理,將Transwell小室置入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,棄去培養(yǎng)液,無菌棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞,PBS洗滌3次,4%多聚甲醛固定,20 min后室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色30 min,PBS洗去染液,自然晾干,倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù),結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲率(%)=藥物組穿膜細(xì)胞數(shù)/陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.2.5Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率將MG63細(xì)胞以5×105個(gè)/ml的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿,加入3 ml培養(yǎng)基,于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,陰性對照組采用DMSO處理,Cos組采用20 μmol/L的Cos處理,每孔設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞處理48 h后,使用0.25%胰蛋白酶消化,收集細(xì)胞,PBS洗滌2次,加入100 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,分別加入Annexin V-FITC與PI熒光染液各5 μl,室溫下避光孵育20 min,采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.2.6Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞,重懸調(diào)整密度為1×107個(gè)/ml,于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。將細(xì)胞分為4組:陰性對照組(DMSO處理),Cos組(20 μmol/L Cos處理),Cos+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑?;切苋パ跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid,TUDC)組(20 μmol/L Cos和500 mg/L TUDC處理)或Cos+自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)組(20 μmol/L Cos和3 mmol/L 3-MA處理)。細(xì)胞處理48 h后,收集各組細(xì)胞,加入RIPA緩沖液裂解細(xì)胞,在4℃、12 000 r/min條件下離心15 min,提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。取等量的蛋白提取液進(jìn)行SDS-PAGE電泳,濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉2 h,分別加入凋亡蛋白Bcl-2抗體(1∶1 000)、Bax抗體(1∶1 000)、Caspase-3抗體(1∶1 000)、Cleaved Caspase-3抗體(1∶1 000)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白eIF2α抗體(1∶1 000)、CHOP抗體(1∶1 000)、PERK抗體(1∶1 000)、自噬蛋白LC3B-Ⅱ抗體(1∶1 000)、Beclin-1抗體(1∶1 000)、p62抗體(1∶1 000),4℃孵育過夜,TBST洗滌10 min×3次,加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(H+L)(1∶5 000),室溫孵育1 h,TBST洗滌10 min×3次,用ECL發(fā)光液顯影,以β-actin為內(nèi)參,分析各條帶灰度值,計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

        1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0和GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差(One-way ANOVA)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1Cos對OS細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響分別使用5、10、15、20、25、40 μmol/L的Cos處理MG36細(xì)胞24 h、48 h、72 h,CCK-8試驗(yàn)結(jié)果顯示,相同作用時(shí)間時(shí),隨著Cos濃度的升高,MG36細(xì)胞增殖活力逐漸降低(P<0.05);相同藥物濃度時(shí),隨著Cos濃度作用時(shí)間的延長,MG36細(xì)胞增殖活力逐漸降低(P<0.05)。說明Cos對MG36細(xì)胞增殖的抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性(圖1A)。因Cos作用24 h時(shí)對MG63細(xì)胞的增殖抑制效果不明顯,72 h時(shí)Cos會過度抑制MG63細(xì)胞增殖,而48 h時(shí)Cos抑制MG63細(xì)胞增殖效果最為有效,故本研究采用48 h作為Cos處理細(xì)胞的時(shí)間。Cos處理MG36細(xì)胞48 h的IC50值為19.21 μmol/L,因此,選取20 μmol/L的Cos用于后續(xù)試驗(yàn)。劃痕試驗(yàn)和Transwell小室試驗(yàn)結(jié)果顯示,與陰性對照組比較,20 μmol/L Cos處理的MG36細(xì)胞遷移、侵襲能力明顯下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1B、C)。

        圖1 Cos對OS細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響Fig.1 Effects of Cos on proliferation,migration and invasion of OS cells

        2.2Cos對OS細(xì)胞凋亡的影響與陰性對照組比較,20 μmol/L Cos干預(yù)MG36細(xì)胞48 h后,細(xì)胞凋亡率明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

        圖2 Cos對OS細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Cos on OS cell apoptosis

        2.3Cos對OS細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與陰性對照組比較,Cos顯著上調(diào)MG36細(xì)胞的eIF2α、CHOP、PERK蛋白表達(dá)水平,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3)。

        圖3 Cos對OS細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of Cos on endoplasmic reticulum stress related protein expression in OS cells

        2.4內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與Cos誘導(dǎo)的OS細(xì)胞凋亡與陰性對照組比較,Cos組Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Cos組比較,Cos+TUDC組Bcl-2蛋白表 達(dá) 水平升 高,Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。

        圖4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與Cos誘導(dǎo)的OS細(xì)胞凋亡Fig.4 Endoplasmic reticulum stress is involved in Cos induced OS cell apoptosis

        2.5Cos對OS細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與陰性對照組比較,Cos顯著上調(diào)MG36細(xì)胞的LC3B-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平,下調(diào)p62蛋白表達(dá)水平,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5)。

        圖5 Cos對OS細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Cos on autophagy related protein expression in OS cells

        2.6自噬參與Cos誘導(dǎo)的OS細(xì)胞凋亡與陰性對照組比較,Cos組Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低,Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與Cos組比較,Cos+3-MA組Bcl-2蛋白表達(dá)水 平升高,Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)。

        圖6 自噬參與Cos誘導(dǎo)的OS細(xì)胞凋亡Fig.6 Autophagy is involved in Cos induced apoptosis of OS cells

        3 討論

        OS是一種高度惡性腫瘤,其典型組織學(xué)特征為重度非典型性和多形性,瘤細(xì)胞大小不等,形態(tài)不一,治療難度較大[12]。盡管臨床有手術(shù)、放化療等多種治療方法,但由于OS轉(zhuǎn)移潛能高,預(yù)后差,患者生存率仍較低。積極探索新的、更有效的治療方法,改善OS患者生存率及生活質(zhì)量尤為必要。近年來,中藥抗腫瘤活性的研究成為熱點(diǎn)。Cos是多種藥用植物的主要活性成分,據(jù)報(bào)道,Cos具有抑制腫瘤增殖和異種移植瘤生長的效果[13]。PENG等[14]研究報(bào)道Cos聯(lián)合去氫木香內(nèi)酯通過c-Myc/p53和AKT/14-3-3途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡抑制乳腺癌。WEI等[15]研究表明Cos可誘導(dǎo)H1299肺癌細(xì)胞凋亡并抑制其遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示,Cos能夠顯著抑制MG36細(xì)胞增殖,并且其抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。同時(shí),Cos還可有效降低MG36細(xì)胞的遷移、侵襲能力,促進(jìn)OS細(xì)胞凋亡。該結(jié)果與JIN等[16]的研究結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)Cos可抑制OS細(xì)胞的遷移和侵襲,Cos具有抗OS的作用。

        CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性蛋白,PERK是具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔結(jié)合域和蛋白激酶活性的細(xì)胞因子,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激初期,啟動的PERK信號通路中PERK通過發(fā)生自體二聚化活化eIF2α,可促進(jìn)細(xì)胞存活,但持久或過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會活化相關(guān)因子誘發(fā)細(xì)胞凋亡,最終促進(jìn)CHOP的表達(dá)[17-18]。細(xì)胞凋亡過程中,抗凋亡Bcl-2蛋白、促凋亡Bax蛋白、凋亡核心蛋白Caspase-3以及活化的Cleaved Caspase-3蛋白均會異常表達(dá)。LIANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)苦參堿通過上調(diào)Bax和Fas/FasL表達(dá)及下調(diào)Bcl-2表達(dá)誘導(dǎo)人OS細(xì)胞凋亡。WANG等[20]發(fā)現(xiàn)Cos通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,Cos可通過上調(diào)MG36細(xì)胞的eIF2α、CHOP、PERK蛋白表達(dá)水平激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑TUDC可以顯著上調(diào)Cos處理的MG36細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)量,顯著下調(diào)Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量。該結(jié)果提示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)Cos誘導(dǎo)的MG36細(xì)胞凋亡。

        自噬是細(xì)胞自我吞噬的過程,屬于一種降解機(jī)制,幫助清除老化、受損的細(xì)胞器,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。大量研究證實(shí),自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用,其可替代凋亡缺陷細(xì)胞抑制腫瘤,同時(shí),誘導(dǎo)細(xì)胞自噬也可抑制細(xì)胞的抗癌活性[21-22]。LC3是自噬中的關(guān)鍵蛋白,其轉(zhuǎn)化為LC3B-Ⅱ是自噬激活的重要標(biāo)志。Beclin-1是一種抑癌基因,其編碼的蛋白是調(diào)控自噬過程的關(guān)鍵蛋白,可通過參與自噬體的形成調(diào)節(jié)自噬活性。p62是一種泛素結(jié)合蛋白,在自噬信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用,其水平可間接反映自噬小體清除水平[23]。WANG等[24]報(bào)道松屬素通過升高Beclin-1和LC3B-Ⅱ的水平、降低p62表達(dá)激活自噬,進(jìn)而調(diào)控糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,Cos可顯著上調(diào)MG36細(xì)胞的LC3B-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)量,下調(diào)p62蛋白表達(dá)量。提示Cos激活MG36細(xì)胞自噬。為探討Cos處理的OS細(xì)胞中自噬對細(xì)胞凋亡的影響作用,本研究使用自噬抑制劑3-MA處理MG36細(xì)胞,結(jié)果顯示,3-MA顯著上調(diào)Cos處理的MG36細(xì) 胞Bcl-2蛋白表達(dá)量,下調(diào)Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量。提示抑制自噬能夠有效減弱Cos誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,自噬參與Cos誘導(dǎo)的MG36細(xì)胞凋亡。

        綜上所述,Cos能夠抑制OS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,誘導(dǎo)OS細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制可能是通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬方面揭示了Cos抗OS的活性,為探索OS的治療提供了新思路。Cos可能通過其他信號通路發(fā)揮抗OS的作用,后期需要進(jìn)一步揭示Cos抗OS的分子機(jī)制。

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