亓照耀 袁海燕 翟林林 曹赟 劉娟 吳艷艷 袁銘 胡婷 楊麗萍

（河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046）

自閉癥（autism spectrum disorders，ASD）是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，其患病率呈逐年上升趨勢。但是，目前針對自閉癥無特效療法，給患者家庭和社會帶來巨大負(fù)擔(dān)。值得注意的是，ASD與孕期的各種危險因素暴露關(guān)系密切［1-2］，但是其具體發(fā)病原因尚未闡明。目前證據(jù)表明，自閉癥患兒易伴隨出現(xiàn)各種胃腸道疾?。?］。此外還發(fā)現(xiàn)自閉癥患者的腸道菌群存在不同程度紊亂，越來越多的證據(jù)也表明腸道菌群和大腦發(fā)育具有密切關(guān)系［4-7］。

丙戊酸（valproic acid，VPA）是一種廣譜抗癲癇藥物，孕期暴露VPA會增加子代患自閉癥風(fēng)險。目前利用孕期暴露VPA建立子代自閉癥大鼠模型成為經(jīng)典的自閉癥模型建模方法［8-9］。盡管曾有報道稱VPA大鼠模型很好地模擬了自閉癥患者的腸道菌群失調(diào)情況［10-11］。但是，這些研究僅分析了模型大鼠的糞便菌群情況，對于不同腸道部位菌群情況的探究還存在空白。本研究對VPA自閉癥模型大鼠的不同腸道部位菌群改變和分布特征進行分析，能夠很好補充ASD與腸道菌群相關(guān)研究，為探討ASD發(fā)病機制及治療思路提供參考。

1 材料與方法

1.1材料Wistar大鼠18只［北京維通利華實驗動物公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006；合格證號：11400700319215］，雌雄比例2∶1，體質(zhì)量雄270～310 g，雌170～220 g。丙戊酸鈉（VPA鈉鹽）（Sigma，批號：1008A021）。本實驗經(jīng)過河南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審查（許可證號：DWLL2018030017），在河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心進行，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度（18±5）℃、濕度（35±10）%和12 h明暗循環(huán)。

1.2方法

1.2.1建模方法適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，選取體格較強壯的大鼠（雌∶雄=2∶1）在21：00合籠，次日7：00檢查是否有陰栓，若有記為受孕0.5 d，反之繼續(xù)合籠。將成功受孕的10只雌鼠按隨機數(shù)字表法平均分為正常組和模型組。所有仔鼠延續(xù)孕鼠分組飼養(yǎng)至28日齡。模型組的孕鼠受孕12.5 d，按600 mg/kg劑量腹腔注射VPA鈉鹽溶液（丙戊酸鈉加生理鹽水配成濃度250 mg/ml的溶液），分娩后利用行為學(xué)實驗選取合格的雄性仔鼠為自閉癥模型組；正常組的孕鼠用無菌生理鹽水代替VPA鈉鹽溶液進行相同操作，分娩仔鼠為正常組。

1.2.2行為學(xué)評價從正常組和模型組的28日齡雄性仔鼠中每窩隨機選取2只，開展行為學(xué)測試。測試期間保持環(huán)境安靜和光線恒定，更換動物時用75%乙醇擦拭測試箱內(nèi)壁和底面，清除前一動物遺留的氣味。攝像機連接于測試箱正上方100 cm處，收集動物的活動視頻、運動軌跡和相關(guān)數(shù)據(jù)，并利用ANY-maze動物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)進行行為學(xué)分析。

1.2.3曠場實驗曠場測試箱（100 cm×100 cm×45 cm）底面分為5×5正方形小格（20 cm×20 cm）。抓住大鼠尾根尖1/3處提起，輕輕放入測試箱正中格，適應(yīng)1 min后，記錄3 min內(nèi)大鼠的水平評分（雙后肢穿過一格記1分）、垂直評分（雙前肢離地直立一次記1分）。

1.2.4社交實驗社交測試箱（60 cm×45 cm×25 cm）被等分為3個測試間（20 cm×45 cm×25 cm）。房間隔斷中間有通道，兩側(cè)房間內(nèi)下角放置圓柱社交籠（直徑12 cm），籠周圍設(shè)為社交區(qū)域（直徑18 cm）。測試前隨機選一側(cè)社交籠放入社交鼠，中間房間放入測試鼠。測試鼠頭部進入社交房間（社交鼠所在房間）社交區(qū)域的次數(shù)為社交次數(shù)，在社交區(qū)域時間為社交時間。

1.2.5刻板行為觀察實驗刻板行為觀察測試箱（50 cm×50 cm×45 cm），將測試鼠置于測試箱適應(yīng)5 min后，測試15 min，通過監(jiān)控記錄測試鼠梳理身上任一處毛發(fā)的次數(shù)和總時間。每只大鼠測試2次后取均值，記錄結(jié)果。

1.2.6腸道微生物取材采用隨機數(shù)字表法從每組中分別選取4只仔鼠進行4個不同腸段的取材。按0.3 ml/100 g的10%水合氯醛麻醉后，超凈工作臺冰面上快速分離腸道組織，吸取出腸內(nèi)容物后于-80℃凍存。本實驗?zāi)c道微生物取材的腸道部位具體規(guī)定為：十二指腸部位（幽門括約肌向下約1.5 cm），空腸部位（空腸的中央部分約2.0 cm），結(jié)腸部位（結(jié)腸的中央部分約2.0 cm），直腸部位（肛門近端約2.0 cm）。

1.2.7高通量擴增測序腸道菌群樣品提取總DNA后，根據(jù)V3-V4區(qū)域設(shè)計得到引物。在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，文庫質(zhì)檢后上機測序。對原始測序序列進行雙端拼接過濾，去除嵌合體得到優(yōu)化序列。將優(yōu)化序列進行聚類，操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），并根據(jù)OTUs的序列組成得到其物種分類；基于OTUs分析結(jié)果，進行Alpha多樣性、Beta多樣性分析和組間差異顯著性分析。本實驗測序的正向引物為：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；反向引物為：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理行為學(xué)和多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)處理采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用xˉ±s形式描述。三組及三組以上數(shù)據(jù)資料，服從正態(tài)分布且方差齊采用ANOVA分析，反之采用Kruskal-Wallis H檢驗。腸道菌群的相關(guān)數(shù)據(jù)分析，均使用BMK微生物多樣性分析平臺（www.biocloud.net）完成，并且采用非加權(quán)算法（Unweighted Unifrac algorithm）。Chao 1指數(shù)代表Alpha豐富度指數(shù)，Shannon指數(shù)代表Alpha多樣性指數(shù)。采用相似度分析（ANOSIM）檢驗兩組樣本之間的Beta多樣性是否存在顯著性差異。PCoA主坐標(biāo)分析（Principal Coordinates Analysis）法比較不同腸段的菌群一致性。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1仔鼠的行為學(xué)評價利用行為學(xué)測試評價模型組仔鼠建模是否成功。與正常組相比，模型組仔鼠曠場實驗的水平評分和垂直評分降低（P＜0.05，圖1A），刻板行為觀察實驗的理毛次數(shù)和總理毛時間明顯增加（P＜0.05，圖1B），社交實驗的社交時間明顯減少社交次數(shù)也減少（P＜0.05，圖1C）。

圖1 仔鼠行為學(xué)評價情況Fig.1 Behavior evaluation of offspring rats

2.2腸道不同部位菌群豐富度和多樣性情況正常組十二指腸和空腸的菌群分布、豐富度和多樣性一致，結(jié)腸和直腸部位一致（R2=0.478，P=0.001）（圖2A、C、E）。與正常組相比，模型組十二指腸菌群豐富度升高（圖2A、B），結(jié)腸和直腸部位多樣性降低（圖2C、D，P＜0.05）。與正常組相比，模型組腸道不同部位的分布無明顯差異（圖2F）。

圖2 腸道不同部位菌群豐富度和多樣性情況Fig.2 Abundance and diversity of gut microbiota in different parts

2.3腸道不同部位菌群相似性情況與正常組相比，模型組十二指腸部位（R2=0.254，P=0.001，圖3A），空腸部位（R2=0.187，P=0.001，圖3B）和直腸部位（R2=0.175，P=0.021，圖3D）菌群相似性具有差異，其中十二指腸部位組間差異最大。在門水平，模型組菌群十二指腸和空腸部位的菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）構(gòu)成。與十二指腸和空腸部位相比，結(jié)腸和直腸部位螺旋體菌門（Spirochaetes）的豐度有所增加。不同腸段間相比，空腸部位的厚壁菌門豐度最高（92.81%），直腸部位的擬桿菌門豐度最高（16.13%），結(jié)腸部位的螺旋體菌門豐度最高（11.28%，圖3E）。

圖3 腸道不同部位菌群相似性情況Fig.3 Similarity of gut microbiota in different parts

2.4腸道不同部位菌群構(gòu)成和差異情況在屬水平，與正常組相比，模型組十二指腸部位Allobaculum屬相對豐度增加，乳酸菌屬（Lactobacillus）、Romboutsia屬、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和Dubosiella屬相對豐度減少（圖4A），直腸部位乳酸菌屬（Lactobacillus）和Prevotellaceae_NK3B31_group相對豐度增加，Allobaculum屬、Dubosiella屬和Romboutsia屬相對豐度減少（圖4B）。在空腸部位，模型組Allobaculum屬占優(yōu)勢，正常組Turicibacter屬占優(yōu)勢（圖4C）。在直腸部位，模型組消化球菌科（Peptococcaceae）占優(yōu)勢，正常組毛螺菌科（Lachnospiraceae）占優(yōu)勢（圖4D、E）。

圖4 腸道不同部位菌群構(gòu)成和差異情況Fig.4 Composition and difference of gut microbiota in different parts

3 討論

ASD發(fā)病率已經(jīng)高達1/59，并呈大幅上升趨勢，且男孩患病概率遠高于女孩［12］。目前ASD致病機制不明，對ASD的深入研究和診療方案的制定都存在巨大挑戰(zhàn)，合理的動物模型可以為其深入研究提供幫助。此外，ASD患兒常伴有腹部不適的癥狀，如便秘、腹瀉和腹痛。有研究發(fā)現(xiàn)，ASD患兒具有特征腸道菌群，其消化道癥狀由特定的腸道微生物引起［7］。且腸道菌群穩(wěn)態(tài)在ASD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，很多研究發(fā)現(xiàn)ASD患兒和對照者間在腸道菌群上存在差異［4-7］。由此可知，腸道微生物穩(wěn)態(tài)與ASD有關(guān)，腸道菌群穩(wěn)態(tài)失衡是ASD發(fā)病的重要影響因素。

VPA大鼠模型是研究ASD的經(jīng)典模型，其不僅在行為學(xué)上與ASD患者相近，且在大腦神經(jīng)發(fā)育學(xué)上也被證實與ASD患者類似［8-9］。此外，VPA自閉癥大鼠模型的腸道菌群改變也與ASD患者相似［10-11］。大鼠的腸道結(jié)構(gòu)和內(nèi)部環(huán)境并不是單一的，具有復(fù)雜的生理結(jié)構(gòu)。并且大鼠的腸道結(jié)構(gòu)與人類類似，主要分為十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸和直腸，腸道不同部位的微生物類型和分布存在差異［13-14］。此外，腸道不同部位黏膜細(xì)胞的作用也不同，吸收腸道菌群的代謝產(chǎn)物可能也存在差異［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組十二指腸和空腸部位的腸道菌群與結(jié)腸和直腸部位的菌群趨于一致，其特異性明顯缺失，這可能是模型組腸道菌群紊亂的原因。模型組不同程度的菌群紊亂可能導(dǎo)致了其菌群代謝產(chǎn)物的吸收代謝異常，進而可能影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。

此外，VPA作為一種孕期暴露的危險因素，其影響腸道菌群的具體機制還不明確。本研究著重比較了不同腸段的菌群豐富度和分布情況。數(shù)據(jù)表明，模型組的腸道菌群分布與正常組相比表現(xiàn)出明顯差異，不同腸段的菌群分布也出現(xiàn)紊亂，特別是結(jié)腸部位特征菌數(shù)量很少。有研究表明，腸道微生物群在指導(dǎo)和促進大腦發(fā)育過程中發(fā)揮了作用［15］，如果在腸道微生物構(gòu)建關(guān)鍵時期發(fā)生的紊亂，可能影響ASD的發(fā)生、發(fā)展過程［16］。更重要的是，腸道微生物早期定植的異常會影響大腦發(fā)育，誘發(fā)ASD癥狀［17］。根據(jù)本研究數(shù)據(jù)，孕期VPA暴露可能影響了子代腸道菌群的定植，特別是改變了不同腸段的菌群特異性。

綜上所述，VPA自閉癥模型大鼠不同部位的腸道菌群出現(xiàn)了不同程度的紊亂，不同腸段腸道菌群特征趨于一致且特征菌減少，特別是十二指腸和空腸部位的腸道菌群差異性缺失。這可能是孕期VPA暴露導(dǎo)致子代腸道菌群紊亂的原因，未來還需要進一步加深對該模型菌群代謝和不同腸段通透性的研究。