范學(xué)偉 ，王鑒波 ，姜 鑫 ，李曉娟 ，陸子秀 ，李樹東

（1.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟職業(yè)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157041；2.牡丹江市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，黑龍江 牡丹江 157041）

近年來在全球暴發(fā)的豬場產(chǎn)房新生仔豬頑固性腹瀉是困擾養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一個大難題，主要感染2～7日齡新生仔豬，感染場產(chǎn)房新生仔豬病死率高達到100%，對發(fā)病場造成巨大經(jīng)濟損失。豬場新生仔豬感染的臨床表現(xiàn)如下：發(fā)病沒有季節(jié)性，一年四季都有可能發(fā)生；哺乳母豬精神狀態(tài)、采食和排便正常；多數(shù)在仔豬吃完初乳后立即發(fā)病，每窩仔豬出現(xiàn)腹瀉達半數(shù)后，母豬就出現(xiàn)回奶現(xiàn)象；腹瀉仔豬發(fā)病初期排黃色油狀稀糞、后變?yōu)辄S水樣稀便、體溫下降、最終脫水消瘦而死；一窩中最初只有1～2頭發(fā)病，后表現(xiàn)為整窩發(fā)病，傳播速度快；發(fā)病急，抗生素和抗病毒藥物治療無效果、死亡率非常高。病死仔豬病理變化：發(fā)生腹瀉仔豬腦部有出血或滲出液、心肌松弛、肝淤血、膽汁充盈、胃脹積食、膀胱積尿、腸系膜淋巴結(jié)腫脹、小腸內(nèi)有黃色稀便、小腸壁菲薄有大量氣體、腎臟變形、腎盂有尿酸鹽結(jié)晶等多種癥狀。

文獻報道能夠引發(fā)產(chǎn)房新生仔豬腹瀉的病原種類較多，包括細菌、病毒、寄生蟲病原體或營養(yǎng)影響因子等。為調(diào)查黑龍江省豬場產(chǎn)房新生仔豬腹瀉的感染病原，筆者所在團隊選擇黑龍江省3個生產(chǎn)條件較好的發(fā)病豬場，結(jié)合新生仔豬臨床表現(xiàn)和病理變化，采集母豬血樣20份/場，共計60份血樣。分離血清進行豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病野毒的抗體檢測，對豬群基礎(chǔ)免疫進行評價。挑選20窩產(chǎn)房腹瀉嚴重豬場無菌采集血液、腦組織、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、十二指腸、小腸內(nèi)容物共計20份，對病料分別進行大腸桿菌分離鑒定，等孢球蟲檢查，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒（RV）、德爾塔病毒（PDCoV）PCR核酸檢測。通過臨床治療和病原檢測雙重分析，確定造成黑龍江地區(qū)豬場產(chǎn)房新生仔豬腹瀉的主要感染病原，為今后豬場在新生仔豬腹瀉防控中提供參考。

1 大腸桿菌分離

1.1 材料與方法

對豬場無菌采取的病死豬的肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)等實質(zhì)性器官作為病原分離材料。無菌條件對深層組織進行劃線并接種于麥康凱瓊脂平板、普通瓊脂平板和血液瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)24 h。

1.2 結(jié)果

利用3種培養(yǎng)基對埃希氏大腸桿菌分離培養(yǎng)的結(jié)果：1）麥康凱培養(yǎng)基上沒有紅色菌落生長；2）未在普通瓊脂培養(yǎng)基上分離到直徑約2 mm的圓形、光滑、濕潤、隆起、半透明淡灰色的菌落；3）血液瓊脂平板上生長的菌落沒有出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象。在豬場采集的實質(zhì)性器官病料中未分離到埃希氏大腸桿菌。

1.3 分析與討論

豬場提供的治療方案，曾對發(fā)生腹瀉仔豬進行抗生素+補液同時治療。按藥物說明對腹瀉仔豬肌注過喹諾酮類和四環(huán)素類藥物，按體重口服氨基糖苷類治療藥物，選擇的這些藥物都是治療腸道大腸桿菌的敏感藥物；為防止仔豬脫水死亡，豬場對腹瀉仔豬進行腹腔補液，補液配方為1 000 mL生理鹽水中添加葡萄糖20 g，碳酸氫鈉2.5 g，氯化鈉3.5 g，氯化鉀1.5 g，抗生素+補液治療腹瀉仔豬沒有治療效果。結(jié)合實驗室的細菌分離結(jié)果，可以確定3個場仔豬腹瀉高死亡率的感染病原并非大腸桿菌。

2 豬等孢球蟲檢查

2.1 材料與方法

對發(fā)病仔豬十二指腸和小腸病料用潔凈的玻璃片或小勺刮取腸道糞便和腸管內(nèi)壁黏液，取4 g腸道刮取物于100 mL潔凈燒杯中，先向燒杯中加入10 mL含尿素的豬球蟲檢測漂浮液，攪拌均勻；再繼續(xù)向燒杯中加入漂浮液40 mL，再次攪拌均勻。重新準備一個同體積的潔凈燒杯，將50 mL的液體刮取物混合液用60目的銅篩過濾到一個同體積的干凈燒杯后靜置，靜置10 min。用取液環(huán)取燒杯濾液表面溶液2滴于載玻片同一位置，覆蓋玻片，完成一個待檢玻片，重復(fù)制作3～5個玻片，置于光學(xué)顯微鏡（10×10）下檢查豬等孢球蟲卵囊，記錄檢測結(jié)果。

2.2 結(jié)果

豬等孢屬球蟲卵囊的形態(tài)特征，卵囊內(nèi)有胚孢子并形成2個孢子囊，每個孢子囊內(nèi)含4個子孢子。對腹瀉仔豬腸道刮取物制備液制成的5份玻片均未檢查到有豬等孢球蟲卵囊。

2. 3 分析與討論

患球蟲病后發(fā)生腹瀉的仔豬，多數(shù)發(fā)病仔豬日齡集中在10～15日齡，3日齡和21日齡腹瀉仔豬糞便中也可檢測到豬等孢球蟲，病程可持續(xù)4～8 d。病初排出黃色水樣的稀糞，糞便污染仔豬全身，散發(fā)出腐敗的酸臭味，經(jīng)過4～5 d糞便轉(zhuǎn)為糊狀的淡綠色糞便；發(fā)生感染的斷奶仔豬感染后約5 d左右出現(xiàn)臨床癥狀，病豬表現(xiàn)出精神沉郁，食欲不振，發(fā)生腹瀉，排出水樣的灰色糞便，糞便中存在少量的腸組織脫落碎屑，發(fā)病癥狀嚴重的嘴唇周圍和腹下皮膚發(fā)紺，快速出現(xiàn)脫水死亡。病豬體況較差，表現(xiàn)消瘦、脫水、發(fā)育遲緩，抗生素治療無效或反復(fù)，死亡率可達10%～50%。

通過對仔豬等孢球蟲感染特點分析，結(jié)合刮腸液玻片檢查結(jié)果，確定送檢豬場新生仔豬腹瀉的感染病原并非是豬等孢球蟲。

3 血清學(xué)抗體檢測

3.1 材料與方法

豬瘟病毒（CSFV）抗體檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗體檢測試劑盒、豬偽狂犬病毒（PRV）抗體（gI）檢測試劑盒（購于北京愛德士元亨生物科技有限公司），酶標儀，洗板機，微量移液器。

3個豬場出現(xiàn)腹瀉母豬的每個場采血20頭，共采樣60血樣，分離血清進行ELISA抗體檢測，所有的試劑盒組分實驗前恢復(fù)到室溫18～25℃。

3.1.1 豬瘟病毒抗體檢測

按照試劑盒說明書操作步驟操作，最后用酶標儀450 nm 處測定樣本以及陰性和陽性對照的吸光度值，獲得被檢樣品的OD450值（ODTEST）、陽性對照的平均值（ODPOS）、陰性對照的平均值（ODNEG）。根據(jù)阻斷率=（ODNEG-ODTEST）/ODNEG× 100%公式計算被檢樣本阻斷率，被檢樣本的阻斷率大于或等于40%，該樣本就可以被判為陽性（有CSFV抗體存在），如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30%，該樣本就可以被判為陰性（無抗CSFV抗體存在）。

3.1.2 豬繁殖與呼吸綜合征（豬藍耳病）病毒抗體檢測

按照試劑盒說明書操作步驟操作，最后用酶標儀650 nm 處測定樣本以及陰性和陽性對照的吸光度值，獲得被檢樣品的OD值樣本A（650）、陽性對照的平均值（OD PCx）、陰性對照的平均值（OD NCx）。根 據(jù)S/P=（A650-NCx）/（OD PCx-OD NCx）公式計算每個樣品S/P值。豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的有無（陽性/陰性）通過計算每個樣品的S/P值判定；如果S/P值低于0.4，樣品應(yīng)判定為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陰性；如果S/P值大于或等于0.4，樣品應(yīng)判定為豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體陽性。

3.1.3 豬偽狂犬病毒（PRV）抗體（gI）檢測

按照試劑盒說明書操作步驟操作，測量并且記錄被檢樣品和對照的A(650)，陰性對照平均值（NC），根據(jù)S/N=樣本A（650）/NC公式計算樣品的S/N值,S/N值低于或等于0.60，樣品應(yīng)判定為PRV gI抗體陽性。S/N值大于0.70，樣品應(yīng)判定為PRV gI抗體陰性。

3.2 結(jié)果

3個豬場母豬豬瘟抗體阻斷率平均值分別為73%、78%、83%，陽性率100%，離散度分別為17%、15%、22%；豬偽狂犬病野毒抗體陽性率全部為0%；豬藍耳病病毒抗體S/P值 平均 值1.3、1.6、1.8，陽性率100%，離散度分別為18%、26%、32%。

3.3 分析與討論

通過對檢測的3個豬場60份血清進行豬瘟、豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征血清學(xué)抗體檢測結(jié)果陽性率和平均值分析，豬場處于免疫合格水平，離散度均小于50%，說明豬場豬瘟、豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征整體免疫較好，對產(chǎn)房新生仔豬腹瀉沒有影響。

4 熒光定量PCR核酸檢測

4.1 材料與方法

豬流行性腹瀉病毒（PEDV ）/豬A群輪狀病毒（GARV ）/豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）三重聯(lián)檢實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，病毒DNA/RNA提取試劑盒（杭州博日科技股份有限公司），賽默飛熒光定量PCR儀（ABI 7500）,采用實時熒光定量PCR檢測方法。對3個豬場挑選20窩腹瀉新生仔豬，采集小腸內(nèi)容物20份進行離心，取上清液200μL制備成20份檢測樣品。

4.1.1 RNA提取

利用核酸提取試劑盒對20份樣品進行RNA核酸提取，分別獲得50μL核酸。

4.1.2 PEDV/GARV/TGEV核酸檢測

1）取PEDV/GARV/TGEV檢測試劑盒，解凍，離心；

2）PCR-MIX配制：21.5μL PCR反應(yīng) 液+1μL酶 混合 液+0.5內(nèi)標，混勻，離心，備用；

3）分別向每個PCR管中加入22.5μL的PCR-MIX；

4）分別向反應(yīng)孔中依次加入2.5μL待檢樣品核酸模板及陰性和陽性對照；

5）擴 增，設(shè) 置FAM檢 測PEDV核酸、HEX檢測GARV核酸、CY5檢測TGEV核酸和ROX檢測內(nèi)標，設(shè)置體系25μL。設(shè)置擴增程序如表1。

表1 擴增程序

結(jié)果判定：

被檢測樣品檢測結(jié)果中FAM通道Ct值≤40,擴增曲線為典型的S型擴增曲線，且ROX內(nèi)標通道Ct值≤35，報告PEDV核酸陽性。

被檢測樣品檢測結(jié)果中HEX通道Ct值≤40，擴增曲線為典型的S型擴增曲線，且ROX內(nèi)標通道Ct值≤35，報告GARV核酸陽性。

被檢測樣品檢測結(jié)果中CY5通道Ct值≤40，擴增曲線為典型的S型擴增曲線，且ROX內(nèi)標通道Ct值≤35，報告TGEV核酸陽性。

4.1.3 PDCoV核酸檢測

1）取PDCoV檢測試劑盒，解凍，離心；

2）PCR-MIX配制：20μLPCR反應(yīng)液加1μL酶混合液混勻，離心，備用；

3）分別向每個PCR管中加入21μL的PCR-MIX；

4）分別向反應(yīng)孔中依次加入4μL4.1.1中的核酸模板及陰性和陽性對照；

5）擴 增，設(shè) 置FAM檢 測PDCoV核酸，設(shè)置擴增程序如表2。

表2 擴增程序

結(jié)果判定：被檢測樣品檢測結(jié)果中FAM通道Ct值≤35，擴增曲線為典型的S型擴增曲線，報告PDCoV核酸陽性。

4.2 結(jié)果

以20份新提取的核酸為模板，進行熒光PCR儀基因擴增：PEDV陽性樣本2份，陽性比例10%；GARV陽性樣本8份，陽性比例40%；TGEV陽性樣本10份，陽性比例50%；PDCoV陽性樣本0份，陽性比例0%。

4.3 分析與討論

通過對3個豬場20窩腹瀉仔豬腸道內(nèi)容物的病原檢測，確定送檢豬場新生仔豬腹瀉病原主要是豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒A群（GARV）。

5 結(jié)論

由于黑龍江地區(qū)豬場對產(chǎn)房新生仔豬腹瀉病原不清，造成防治難度大，治療成本高，效果不理想。研究選取黑龍江省發(fā)生新生仔豬腹瀉的3個豬場進行病原調(diào)查分析，精心設(shè)計試驗。對發(fā)病場進行大腸桿菌分離、孢球蟲檢查、豬瘟抗體、豬偽狂犬病野毒抗體、豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測，對豬流行性腹瀉病毒、豬A群輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬德爾塔冠狀病毒進行核酸檢測。結(jié)合血清學(xué)抗體檢測、等孢球蟲檢測、熒光定量PC檢測試驗結(jié)果，確定3個豬場新生仔豬腹瀉的病原為豬流行性腹瀉病毒、豬A群輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒。本研究為區(qū)域內(nèi)豬場防治產(chǎn)房新生仔豬腹瀉指明了方向，為豬場管理者在后備豬引種馴化、病原凈化以及腹瀉疫苗的選擇提供了參考。