陳星灼，張星星，陳俊錕，陳建軍，吳彥利，王 濤，秦信蓉*

(1.貴州省油菜研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006；2.重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 408000)

0 引言

【研究意義】油菜(BrassicanapusL.)是我國(guó)種植面積最大、分布最廣的油料作物。由于長(zhǎng)期對(duì)油菜馴化和定向選擇，其遺傳基礎(chǔ)面臨漸趨狹窄的問題[1]。利用化學(xué)試劑誘發(fā)植株發(fā)生遺傳變異是一種能豐富遺傳基礎(chǔ)的育種技術(shù)，對(duì)農(nóng)作物品種培育具有直接或間接的生產(chǎn)價(jià)值[2]。其中，利用甲基磺酸乙酯(EMS)誘變是一種技術(shù)成熟、高效簡(jiǎn)便、成本較低的誘變方法[3]，具有點(diǎn)突變比例較高、染色體畸變少等優(yōu)點(diǎn)，且EMS誘變產(chǎn)生的表型變異體后代分離的基因數(shù)量較少，便于篩選和利用[4]。當(dāng)今，國(guó)際食用植物油價(jià)不斷上漲，國(guó)內(nèi)產(chǎn)需缺口越來(lái)越大，研究EMS誘變對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油菜新品種對(duì)保障國(guó)家糧食安全具有深遠(yuǎn)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，EMS誘變育種技術(shù)已廣泛應(yīng)用于油菜[5]、水稻[6]、玉米[7]、大豆[8]、谷子[9]等作物上，可在一定程度上改良作物的部分品質(zhì)和性狀。黃永娟等[10]利用EMS誘變獲得了甘藍(lán)型油菜的高油酸突變體；HANS-JOACHIM等[11]通過(guò)EMS誘變獲得了甘藍(lán)型油菜的低芥酸突變體；李昕等[12]利用EMS誘變獲得了甘藍(lán)型油菜的矮稈突變體?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】EMS誘變甘藍(lán)型油菜研究多集中于對(duì)某一方面的影響進(jìn)行分析，有關(guān)綜合分析EMS誘變對(duì)甘藍(lán)型油菜發(fā)芽率和多種農(nóng)藝性狀變異的影響研究鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】用不同濃度EMS誘變處理甘藍(lán)型油菜種子，以發(fā)芽率的半致死量(LD50)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)誘變后油菜植株的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，從而獲得適宜的誘變條件，以期為構(gòu)建甘藍(lán)型油菜突變體庫(kù)、豐富基礎(chǔ)資源材料和進(jìn)一步改良油菜品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試油菜品種為甘藍(lán)型油菜品系9226，由貴州省油菜研究所選育。

1.2 方法

1.2.1 EMS處理 選取適量完整飽滿的甘藍(lán)型油菜成熟種子，在20℃條件下用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液浸泡12 h。用吸水紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)入剪掉管蓋的2 mL離心管。每個(gè)離心管放100粒種子，分別添加濃度為0(CK)、0.4%、0.8%、1.4%、1.8%和2.0%的EMS磷酸緩沖液，于20℃下處理8 h，每處理3次重復(fù)，全程在通風(fēng)櫥下進(jìn)行。處理完成后將離心管中的EMS磷酸緩沖液倒入10% NaS2O3溶液中，進(jìn)行中止反應(yīng)無(wú)害化處理，再將盛有種子的離心管浸沒于流水沖洗4 h。取出沖洗干凈的種子用吸水紙吸干水分，轉(zhuǎn)入墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿均勻鋪開，加入5 mL純凈水濕潤(rùn)濾紙，放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。光照培養(yǎng)箱設(shè)置溫度25℃，光照培養(yǎng)7 d，每天6:00—9:00打開光照，其余時(shí)間關(guān)閉光照。以發(fā)芽率的半致死量(LD50)作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在培養(yǎng)第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，確定誘變甘藍(lán)型油菜的最佳EMS濃度。

1.2.2 田間觀察與統(tǒng)計(jì) 將EMS誘變處理后的種子(M1)單粒點(diǎn)播于田間，田間管理按一般試驗(yàn)田進(jìn)行。通過(guò)觀察M1植株外觀性狀表現(xiàn)，根據(jù)性狀變異對(duì)M1單株進(jìn)行大致分類并連續(xù)多代套袋自交至M4，得到農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的突變體株系，以正常甘藍(lán)型油菜(未經(jīng)EMS誘變)為對(duì)照(CK)，進(jìn)行考種分析，考察指標(biāo)包括株高、第一有效分支部位高度、一次有效分支數(shù)、主花序有效長(zhǎng)度、主花序角果數(shù)、全株有效角果數(shù)、角果長(zhǎng)度和每角粒數(shù)等。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用DPS V 17.1和Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度EMS誘變處理甘藍(lán)型油菜的種子發(fā)芽率

由表1可知，油菜種子發(fā)芽率隨EMS濃度的增加而降低。與CK相比，EMS濃度為0.4%時(shí)，油菜種子發(fā)芽率下降6百分點(diǎn)；濃度為0.8%時(shí)，下降16百分點(diǎn)；濃度為1.4%時(shí)，下降42百分點(diǎn)，接近半致死率；濃度為1.8%時(shí)，下降54百分點(diǎn)；濃度為2.0%時(shí)，降幅最大，達(dá)63百分點(diǎn)。因此，選取1.4%EMS溶液處理后獲得的誘變種子播種于大田。

表1 不同濃度EMS誘變處理甘藍(lán)型油菜種子的發(fā)芽率Table 1 Seed germination rate of B. napus with different concentrations of EMS

2.2 EMS突變體株系的農(nóng)藝性狀

從表2看出，甘藍(lán)型油菜種子經(jīng)誘變處理后植株的農(nóng)藝性狀指標(biāo)存在豐富變異。M4的突變體株系株高、第一有效分枝部位高度、一次有效分枝數(shù)、主花序有效長(zhǎng)度、主花序角果數(shù)、全株有效角果數(shù)、角果長(zhǎng)度和每角粒數(shù)分別為131.67～216.00 cm、43.33～131.00 cm、4～11個(gè)、36～82 cm、36.67～153.60個(gè)、126.00～934.40個(gè)、3.89～9.00 cm和9.60～27.92粒，均值分別為183.08 cm、89.09 cm、6.70個(gè)、56.73 cm、74.90個(gè)、376.95個(gè)、5.84 cm和17.67粒。變異系數(shù)依次為全株有效角果數(shù)>主花序角果數(shù)>每角粒數(shù)>第一有效分枝部位高度=一次有效分枝數(shù)>角果長(zhǎng)度>主花序有效長(zhǎng)度>株高。變異系數(shù)大于0.2的有全株有效角果數(shù)、主花序角果數(shù)、每角粒數(shù)、第一有效分枝部位高度、一次有效分枝數(shù)和角果長(zhǎng)度，表明其受EMS誘變影響較大，變異類型豐富，以全株有效角果數(shù)最高，誘變影響最為突出；變異系數(shù)小于0.1的有主花序有效長(zhǎng)度和株高，說(shuō)明其受誘變影響較小。

表2 EMS誘變突變體株系(M4)的農(nóng)藝性狀Table 2 Agronomic traits of M4 (EMS mutagenic lines)

2.3 EMS誘變突變體株系的相關(guān)性

由表3可知，部分農(nóng)藝性狀間具有緊密聯(lián)系。其中，株高與第一有效分支部位高度呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.635；與主花序有效長(zhǎng)度和角果長(zhǎng)度呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.294和0.289。第一有效分支部位高度與每角粒數(shù)呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.435；與全株有效角果數(shù)和主花序有效長(zhǎng)度分別呈極顯著負(fù)相關(guān)和顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.392和-0.291。一次有效分支數(shù)與全株有效角果數(shù)呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.703。每角粒數(shù)與全株有效角果數(shù)和角果長(zhǎng)度分別呈極顯著負(fù)相關(guān)和極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.400和0.456。

表3 EMS誘變突變體株系的相關(guān)系數(shù)Table 3 Correlation coefficients of EMS mutagenic lines

2.4 EMS誘變突變體株系的聚類

由圖1和表4可知，在歐式距離3.75處可將CK和突變體株系分為3個(gè)類群，Ⅰ類包含23個(gè)突變體株系，進(jìn)一步分為ⅠA(12個(gè))和ⅠB(11個(gè))亞類，其株高和主花序有效長(zhǎng)度均為最低，分別為181.84 cm和54.88 cm。Ⅱ類包含2個(gè)突變體株系，其株高、主花序有效長(zhǎng)度和主花序角果數(shù)均為最高，分別為187.50 cm、63.00 cm和82.20個(gè)；角果長(zhǎng)度最低，為5.40 cm。Ⅲ類包含18個(gè)突變體株系，分為ⅢA(5個(gè))和ⅢB(13個(gè))亞類，CK聚類在ⅢB中，其第一有效分支部高、角果長(zhǎng)度和每角粒數(shù)最高，分別為94.80 cm、6.36 cm和19.30粒；一次有效分枝數(shù)、主花序角果數(shù)和全株有效角果數(shù)最低，分別為5.80 cm、66.58個(gè)和220.11個(gè)。Ⅳ類包含4個(gè)突變體株系，分為ⅣA(3個(gè))和ⅣB(1個(gè))，其一次有效分支數(shù)和全株有效角果數(shù)最大，分別為9.59個(gè)和867.73個(gè)；第一有效分枝部高和每角粒數(shù)最小，分別為62.63 cm和14.42個(gè)。

圖1 EMS誘變突變體株系的聚類樹Fig.1 Cluster tree of EMS mutagenic lines

表4 EMS誘變突變體各類群株系的農(nóng)藝性狀指標(biāo)Table 4 Indexes of various agronomic traits of EMS mutagenic lines

3 討論

通過(guò)EMS誘變可獲得種類豐富的甘藍(lán)型油菜突變體，并根據(jù)其突變體農(nóng)藝性狀的變異情況進(jìn)行篩選和分類，從而構(gòu)建油菜突變體庫(kù)，對(duì)育種材料的創(chuàng)制、構(gòu)建橋梁親本和種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。EMS處理后，植物的組織器官皆可能發(fā)生表型突變，但突變頻率有所差異[13]。前人研究表明，EMS處理濃度越高，突變體株系的花、葉片和株型等性狀突變頻率越高，在構(gòu)建EMS突變體庫(kù)時(shí)，誘變濃度可參照半致死劑量[13-15]。研究結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜種子用EMS誘變的最佳處理濃度為1.4%，并獲得多個(gè)突變體株系，與陳碧云等[13-15]的研究結(jié)果有所差別，可能是由于所用試材不同而導(dǎo)致。不同試驗(yàn)材料經(jīng)過(guò)EMS誘變后的突變體性狀變異存在差異，廖曉英等[15]通過(guò)EMS誘變野生甘藍(lán)型油菜玻里馬胞質(zhì)雄性不育系的保持系，獲得矮稈突變體，其主花序角果數(shù)、一次有效分枝數(shù)、每角粒數(shù)、角果長(zhǎng)度、千粒重和單株產(chǎn)量顯著低于對(duì)照；李浩杰等[16]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)EMS誘變獲得的變異株系的角果長(zhǎng)度、全株有效角果數(shù)、粒重和角粒數(shù)等性狀顯著或極顯著高于對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果顯示，變異株系的全株有效角果數(shù)、主花序角果數(shù)、每角粒數(shù)、第一有效分枝、一次有效分枝數(shù)和角果長(zhǎng)度等受EMS誘變影響較大，變異類型豐富，與楊建勝等[17]的研究結(jié)果相似。但其株高受誘變影響較小，可能與誘變材料特性和EMS濃度導(dǎo)致部分材料不能正常萌發(fā)有關(guān)。試驗(yàn)利用EMS誘變甘藍(lán)型油菜品系9226種子，獲得株高降低、角果增長(zhǎng)、角果數(shù)增多和一次有效分枝數(shù)增多的4類材料，同時(shí)獲得少許花色變異、主花序長(zhǎng)度增長(zhǎng)和角果粒數(shù)增多的突變體，可為建立甘藍(lán)型油菜突變體庫(kù)和豐富育種材料提供參考。但其采用的誘變材料較為單一，未能更好地消除材料差異對(duì)EMS處理最適條件的影響，今后可豐富EMS誘變處理材料，擴(kuò)大材料類型，在獲得突變體材料基礎(chǔ)上結(jié)合分子手段進(jìn)一步對(duì)EMS產(chǎn)生的誘變影響進(jìn)行遺傳分析。

4 結(jié)論

甘藍(lán)型油菜在不同濃度EMS處理下產(chǎn)生的效應(yīng)不同。EMS誘變最佳濃度為1.4%，在此條件下，發(fā)芽率接近半致死量，且能適應(yīng)EMS的損害。獲得變異株系的農(nóng)藝性狀指標(biāo)存在豐富變異，變異系數(shù)依次為全株有效角果數(shù)>主花序角果數(shù)>每角粒數(shù)>第一有效分枝部高度=一次有效分枝數(shù)>角果長(zhǎng)度>主花序有效長(zhǎng)度>株高；全株有效角果數(shù)變異系數(shù)最高，為0.50，其誘變影響最為突出。部分農(nóng)藝性狀間具有緊密聯(lián)系，呈顯著或極顯著相關(guān)。變異株系分為株高降低(Ⅰ類)、角果數(shù)增多(Ⅱ類)、角果增長(zhǎng)(Ⅲ類)和一次有效分枝數(shù)增多(Ⅳ類)4類。