郝 杰，李俊暉，王陳璐，高文清， 石守東，俞建成，唐科奇

(1.寧波大學(xué)質(zhì)譜技術(shù)與應(yīng)用研究院，浙江 寧波 315211； 2.寧波大學(xué)高端質(zhì)譜技術(shù)和臨床應(yīng)用浙江省工程研究中心，浙江 寧波 315211； 3.寧波大學(xué)信息科學(xué)與工程學(xué)院，浙江 寧波 315211；4.寧波大學(xué)材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

糖類是生物體內(nèi)重要的供能物質(zhì)，直接參與細胞識別及活性調(diào)控，與腫瘤、糖尿病等惡性疾病的發(fā)生密切相關(guān)[1-4]。因此，深入研究糖類化合物在生物體內(nèi)的種類、結(jié)構(gòu)及功能，對于理解生命進程及疾病的發(fā)生機理至關(guān)重要。然而，糖類物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且存在大量的同分異構(gòu)體，為糖組學(xué)的深入研究帶來了困難[5-8]。

近年來，離子遷移譜技術(shù)(IMS)憑借分析速度快、能分離同分異構(gòu)體等特點，逐漸成為糖類化合物研究的新選擇[6-8]。傳統(tǒng)的IMS技術(shù)通常在一個填充惰性氣體的漂移管內(nèi)建立軸向均勻靜電場，由于離子的遷移率(K)存在差異，在靜電場作用下以不同的速度穿過漂移管，從而實現(xiàn)分離與識別[7-9]。但目前商業(yè)化的IMS儀器受限于可實現(xiàn)的分辨力(最高約200)，難以有效分離結(jié)構(gòu)相似的糖類同分異構(gòu)體[6-9]。新興的高場非對稱離子遷移譜(FAIMS)技術(shù)已被證明可實現(xiàn)更高的結(jié)構(gòu)分辨力(最高約500)，與質(zhì)譜之間有更好的正交性，并且在同等分辨力下,對脂類、氨基酸、多糖等物質(zhì)的分離效果約為IMS的3～4倍，為糖組學(xué)研究提供了支持[9-12]。

不同于IMS，F(xiàn)AIMS能夠利用離子在強弱電場間遷移率的差異實現(xiàn)離子的分離。高場下離子遷移率K與電場E的關(guān)系通常采用1個偶次冪的多項式來表達[13-15]：

K(E/N)=K(0)·[1+a·(E/N)2+

b·(E/N)4+c·(E/N)6+…]

(1)

式中，K(0)為標準大氣壓(101.325 kPa)和標準溫度(0 ℃)下的離子遷移率，N為環(huán)境氣體的數(shù)密度，E/N為歸一化的電場強度。離子遷移率可能隨電場強度的增強而升高(A類離子)、下降(C類離子)或先升高后下降(B類離子)[16-17]。在此條件下，F(xiàn)AIMS利用不同離子在高低電場間遷移率差(ΔK(E))的不同，實現(xiàn)離子在垂直距離上的分離[17-19]。通常，F(xiàn)AIMS由2塊電極板組合而成(可組合為圓筒型或平行型)，極板間留1段細微間隙。通過將特定的周期性非對稱變化的高壓波形(分離電壓(DV))連接在其中1塊電極板上，2塊極板間將形成1個非對稱變化的電場。當離子被恒流氣體帶入FAIMS間隙后，在每個DV周期下，離子都將向其中1塊極板方向偏移，并在多個周期后最終在極板上被中和[18-20]。為了使具有特定ΔK(E)的離子穿過FAIMS間隙，需要將合適的補償電壓(CV)疊加在DV上，使離子反向移動，以抵消每個DV周期引起的偏移。因此，F(xiàn)AIMS常采用1個以固定速度變化的CV波形進行掃描，以此獲得不同離子的分布譜圖[18-21]。

為利用FAIMS實現(xiàn)糖類同分異構(gòu)體的有效分離，本文擬研發(fā)一款配套零相位濾波算法和基于二階導(dǎo)及改進粒子群算法的重疊峰分離算法、可獨立使用的平板型FAIMS裝置，使其能夠在分離離子、過濾信號噪聲的同時，實現(xiàn)FAIMS重疊峰中各峰的精準、快速提取，由此提升FAIMS數(shù)據(jù)的可讀性及分析結(jié)果的準確性。同時，利用蔗糖、麥芽糖樣品測試該裝置對糖類同分異構(gòu)體的分離效果，分析FAIMS載氣中氦氣比例對其分辨率/分辨力、糖類離子結(jié)構(gòu)及糖類同分異構(gòu)體譜峰分離度的影響，旨建立一套基于FAIMS的糖類異構(gòu)體分析新方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

本實驗使用的FAIMS分離裝置與文獻[22-24]報道類似，其結(jié)構(gòu)示意圖示于圖1。該裝置主要由2塊平行的光滑不銹鋼電極板(長6.6 cm，寬3.55 cm)組成，極板間保留1.88 mm的間隙。FAIMS DV連接在底部極板(DV極板)，F(xiàn)AIMS CV連接在頂部極板(CV極板)。CV極板上方覆蓋1塊簾幕極板，中間存在1個直徑2 mm的離子入口。CV極板上同樣存在1個與前述入口同軸的直徑1 mm的離子入口。

圖1 獨立FAIMS分離裝置結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of the standalone FAIMS system

通過在簾幕極板上施加1 kV的直流電壓，氣相離子將在電壓作用下經(jīng)由2個入口進入FAIMS間隙內(nèi)。在CV極板和簾幕極板間存在1個載氣入口，載氣為氮氣、氦氣的混合氣體，其流速及成分比例由瑞士Axetris公司生產(chǎn)的數(shù)字流量計控制。其中，MFC2242-DJ-U0、MFC2242-CF-U0流量計分別用于控制氮氣和氦氣的流速。載氣在進入簾幕極板和CV電極的間隙后，將根據(jù)2個離子入口直徑的不同被分成2部分。其中，約70%的載氣將從簾幕極板的入口流出，用于ESI源中液滴的去溶劑化；而剩余約30%的氣體將流入FAIMS，以攜帶離子通過間隙[23-24]。1個直徑6 cm的不銹鋼圓形網(wǎng)罩將作為電荷收集器安裝在FAIMS離子出口處收集全部離子；美國Keithley公司生產(chǎn)的No.6514高靈敏度靜電計則被用于測量電荷收集器上采集得到的離子電流信號。為了消除FAIMS DV電場在離子電流測量過程中產(chǎn)生的射頻干擾，整個裝置被安裝在1個矩形不銹鋼的接地屏蔽殼內(nèi)運行。

本實驗所有的分析物離子均由nano-ESI電噴霧離子源電離產(chǎn)生。其中，ESI噴針為美國New Objective公司產(chǎn)品，外徑320 μm，內(nèi)徑50 μm。噴針通過2個不銹鋼接頭連接到美國Hamilton公司生產(chǎn)的0.5 mL注射器上。使用中國蘭格恒流泵有限公司生產(chǎn)的LSP01-1A進樣泵將樣品溶液注入噴針，并利用天津東文高壓電源股份有限公司生產(chǎn)的DW-P502-1F74高壓直流電源模塊在ESI噴針上添加直流高壓電以形成電噴霧。本實驗還將FAIMS裝置與Agilent 6560 IMS-QTOF質(zhì)譜儀聯(lián)用，用于檢測FAIMS譜峰離子的質(zhì)荷比。

1.2 主要材料與試劑

蔗糖：分析純，上海滬試實驗室器材股份有限公司產(chǎn)品；麥芽糖：分析純，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙酸：色譜純，美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；超純水：由美國Millipore公司生產(chǎn)的Milli-Q系統(tǒng)制備。

樣品溶劑：甲醇-超純水-乙酸(50∶49∶1，V/V/V)混合試劑；10 mmol/L標準儲備液：稱取34.2 mg蔗糖和麥芽糖樣本，分別溶解于10 mL樣品溶劑；5 mmol/L樣品溶液：移取3 mL蔗糖和麥芽糖標準儲備液，分別與3 mL樣品溶劑充分混合。

1.3 實驗條件

將頻率965 kHz/幅值2.54 kV和頻率1 930 kHz/幅值1.27 kV的雙正弦波以90°相位差組合后作為FAIMS DV，其電壓幅值將在-1.9～3.8 kV范圍內(nèi)非對稱變化。FAIMS CV是一段連續(xù)掃描的鋸齒波，其掃描范圍為-20～+20 V，掃描速率為0.1 V/s。為保證FAIMS信號的最佳靈敏度及穩(wěn)定性，ESI進樣速率設(shè)為300 nL/min，F(xiàn)AIMS載氣流速為3 L/min，ESI噴針連接了4 kV直流高壓電并被放置在距簾幕極板離子入口約3 mm處。同時，載氣中的氦氣比例將在0%～40%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)以避免放電。為了確定FAIMS譜圖中分析物離子對應(yīng)的譜峰，在實驗過程中測量了不同濃度樣品試劑的譜圖。對于信號強度隨樣品濃度下降接近等比例變化的峰，將被確定為分析物所對應(yīng)的譜峰，F(xiàn)AIMS譜峰離子的質(zhì)荷比也被用于進一步驗證結(jié)果的準確性。為保證數(shù)據(jù)的有效性，每組實驗數(shù)據(jù)均重復(fù)采集5次。

在采集得到的FAIMS信號中，常存在明顯的噪聲干擾及譜峰重疊現(xiàn)象，難以提取譜峰的CV值、半峰寬等重要信息，以及定性分析物。零相位數(shù)字濾波算法能在有效過濾FAIMS噪聲的同時保留有效信號，有助于提升儀器的檢測限[9]；基于二階導(dǎo)及改進粒子群算法的重疊峰分離算法能夠在3～5 s內(nèi)實現(xiàn)譜圖中重疊峰的精準分離，并提供各單峰的峰強、峰寬等重要信息[25-26]。因此，本研究擬將FAIMS裝置與上述2種算法相結(jié)合，在信號濾噪的基礎(chǔ)上對重疊峰進行分離，以提升FAIMS裝置對物質(zhì)定性分析的準確性。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖譜圖分析

為評估FAIMS裝置對糖類物質(zhì)的分離效果，首先檢測了5、10 mmol/L蔗糖樣品的FAIMS譜圖，示于圖2。在3 L/min純氮氣條件下，不加FAIMS屏蔽殼，高頻高壓的FAIMS DV將對采集金屬網(wǎng)產(chǎn)生嚴重的噪聲干擾，因此僅能采集得到噪聲信號，示于圖2a。在添加屏蔽殼后可有效抑制射頻干擾，從而能采集到有效的蔗糖FAIMS譜圖，示于圖2b，在得到的譜圖中存在4個未完全分離的譜峰，分別標記為1、2、3、4，且譜圖中仍然存在明顯的噪聲干擾，影響了進一步分析。因此，采用零相位數(shù)字濾波算法對圖2b中的信號進行濾波處理，相較于原始譜圖，信號光滑度及信噪比均明顯提升，能更精準地提取FAIMS譜峰的CV值、半峰寬等信息，示于圖2c。其中，峰3、4在蔗糖樣品濃度變化的過程中未發(fā)生明顯改變，推測是由溶劑產(chǎn)生的背景峰；峰1、2的信號強度隨蔗糖樣品濃度的下降發(fā)生明顯變化，推測可能是蔗糖離子對應(yīng)的譜峰。為進一步驗證峰1、2，將FAIMS裝置與Agilent 6560 IMS-Q TOF質(zhì)譜儀聯(lián)用，獲得的質(zhì)譜圖示于圖2d，根據(jù)其中蔗糖離子m/z343.12[Sucrose+H]+篩選了FAIMS譜圖，示于圖2e，篩選后的譜圖中僅存在峰1、2，因此可確定其為蔗糖離子信號，且存在2種不同的結(jié)構(gòu)。與文獻[17,24]報道相同，在波峰強度遠大于波谷強度絕對值的正FAIMS DV條件下，蔗糖離子峰1、2對應(yīng)的CV值分別為-6.8、-4.8 V，表明其屬于遷移率隨電場強度增強而下降的C類離子。

在類似的離子化條件下，IMS甚至高分辨捕集離子遷移譜(TIMS)裝置采集得到的蔗糖離子遷移譜圖中，幾乎都顯示蔗糖樣品僅存在單一結(jié)構(gòu)[6,27-28]。2020年，Li等[6]利用3-吡啶硼酸對二糖離子進行衍生化處理，在顯著提升二糖離子間的結(jié)構(gòu)差異后，使用高分辨TIMS-TOF檢測，發(fā)現(xiàn)由于離子化位點不同，蔗糖離子存在2種結(jié)構(gòu)。本研究利用平板型FAIMS，在不采取衍生化處理的情況下，就能觀察到蔗糖離子的雙重結(jié)構(gòu)。這一結(jié)果與利用離子遷移譜技術(shù)對多肽及蛋白質(zhì)進行結(jié)構(gòu)多樣性分析的實驗類似，證明了分辨力有限的IMS設(shè)備難以對結(jié)構(gòu)高度相似的異構(gòu)體離子實現(xiàn)有效分離；而相較于低場下的特定K，不同結(jié)構(gòu)離子在高低電場間的ΔK(E)常存在明顯差異，這使得FAIMS對離子的結(jié)構(gòu)差異更加敏感，因此能夠分離出結(jié)構(gòu)相似而IMS無法分離的異構(gòu)體離子[22,29-30]。但由于FAIMS對不同結(jié)構(gòu)離子的分離原理尚不明確，雖可分離異構(gòu)體離子，但特定離子異構(gòu)體的CV值及結(jié)構(gòu)尚無法相互推導(dǎo)說明。將FAIMS與IMS聯(lián)用，憑借離子的IMS漂移橫截面積及嚴格的分子動力學(xué)計算模型有望解決這一問題。

2.2 載氣時FAIMS分辨力的影響

有研究表明[10-12]，利用氮氣/氦氣的混合氣體代替純氮氣作為FAIMS載氣，可顯著提升FAIMS的分辨力。由于圖2c中的4個譜峰存在明顯的重疊，為進一步提升FAIMS對蔗糖譜峰的分離效果，并評估該裝置的分辨力，本研究采集了不同氮氣/氦氣比例下蔗糖的FAIMS譜圖，示于圖3?？捎^察到隨著氦氣比例的增加，各譜峰對應(yīng)的CV絕對值均明顯提高；當氦氣比例超過30%時，蔗糖譜峰和背景峰可實現(xiàn)基線分離，而背景峰3的右肩處也逐漸演化出2個新的譜峰。結(jié)果表明，隨著載氣中氦氣比例的增加，F(xiàn)AIMS的分辨力得到了顯著提升。

注：a.未添加屏蔽殼的FAIMS譜圖；b.添加屏蔽殼的FAIMS譜圖；c.算法濾噪后的FAIMS譜圖； d.采集得到的MS譜圖；e.根據(jù)特征離子篩選的蔗糖離子FAIMS譜圖圖2 5 mmol/L及10 mmol/L蔗糖溶液的FAIMS及MS譜圖 Fig.2 FAIMS and MS spectra of sucrose solutions with the concentrations of 5 mmol/L and 10 mmol/L

在氦氣比例增加的過程中，蔗糖離子雙峰始終保持重合狀態(tài)，且重合度不斷提高。因此，為分析蔗糖離子雙峰在不同氦氣比例下的變化過程，利用基于二階導(dǎo)及改進粒子群算法的重疊峰分離算法，提取了10 mmol/L蔗糖譜圖中的雙峰信號。分離后的蔗糖雙峰示于圖4，當載氣中氦氣比例低于40%時，該算法能有效分離信號中的重疊峰，且蔗糖雙峰CV絕對值的差值隨氦氣的增加不斷變??；當氦氣比例達到30%時，雙峰1、2的CV差值由100%氮氣時的2 V減小為1.3 V，分辨率下降，由此導(dǎo)致雙峰重合度提高；當氦氣比例大于40%時，豐度較低的峰2被峰1完全覆蓋，無法通過算法實現(xiàn)分離。

注：a.10%;b.20%;c.30%;d.40%圖3 不同氦氣比例下，不同濃度蔗糖溶液的FAIMS譜圖Fig.3 FAIMS spectra of sucrose solutions at different concentrations with different He percentages

注：a.0%;b.10%;c.20%;d.30%;e.40%圖4 不同氦氣比例下，利用分離算法提取的蔗糖譜峰Fig.4 FAIMS spectra of sucrose solution resolved by separation algorithm with different He percentage

由圖4中的半峰寬可知，在氦氣比例由0%提高至30%過程中，峰1的峰寬減小0.06 V的同時，峰2的峰寬增加了0.12 V。這主要是由于FAIMS DV在分離不同結(jié)構(gòu)離子的同時對離子存在加熱效果，且加熱溫度隨氦氣比例的增加不斷提高。當加熱溫度超過一定閾值時，特定離子的結(jié)構(gòu)將逐漸向更穩(wěn)定的方向變化。對于同分異構(gòu)體，在FAIMS中特定構(gòu)型離子所對應(yīng)的CV絕對值越大，一般其結(jié)構(gòu)較其他異構(gòu)體更緊湊，受到FAIMS DV加熱后更容易向展開的結(jié)構(gòu)演化[23,29,31]。因此，隨著氦氣比例(加熱溫度)的不斷增加，峰1的結(jié)構(gòu)逐漸向峰2演化，由此造成離子間結(jié)構(gòu)差異變小、雙峰重合度提高，F(xiàn)AIMS分辨力提高，部分加熱展開后的離子逐漸從峰1中被分離出來，造成峰1逐漸變窄，這些被解析出的離子結(jié)構(gòu)逐漸接近峰2，被算法判定為是峰2的一部分，導(dǎo)致峰2逐漸變寬。上述實驗結(jié)果解釋了糖類離子結(jié)構(gòu)在FAIMS加熱影響下的衍變過程，說明基于二階導(dǎo)及改進粒子群算法的重疊峰分離算法能有效分離FAIMS譜圖中的重疊信號，從而對信號峰的豐度比、CV值、半峰寬、譜峰重合度等信息實現(xiàn)更精準的分析，顯著提升了FAIMS儀器的整體性能。

為進一步評估氦氣比例對FAIMS分辨率(resolution,R)及分辨力(resolving power,r)的影響，按式(2)和式(3)進行計算[10-11]：

r=|CVP|/wh

(2)

R=2.35|CVP1-CVP2|/(2wh1+2wh2)

(3)

其中，CVP是FAIMS譜峰在最大峰強處對應(yīng)的CV值，wh是譜峰對應(yīng)的半峰寬,CVP1和CVP2是相鄰兩峰在最大峰強處對應(yīng)的CV值，wh1和wh2是相鄰兩峰對應(yīng)的半峰寬。默認40%氦氣下的峰為峰1，根據(jù)圖4中標記的蔗糖雙峰的CVP及wh，分別計算了不同氦氣比例下蔗糖雙峰對應(yīng)的分辨力及分辨率，示于圖5。隨著氦氣比例的增加，利用蔗糖雙峰數(shù)據(jù)計算得到的分辨力值均相應(yīng)提高。雖然峰2的CVP絕對值明顯小于峰1，但由于其峰寬更窄，因此實際計算得到的分辨力更高。相較于肽類、蛋白質(zhì)類等可帶多電荷的物質(zhì)，在本研究的溶劑條件下，蔗糖僅能帶單電荷，因此CVP絕對值較小。同時，在相同實驗條件下，蔗糖譜峰明顯寬于肽類等的譜峰(約為血管緊張素Ⅰ的2倍，緩激肽的4倍[9,24])，導(dǎo)致目前計算得到的最大分辨力僅為7.32，遠低于FAIMS裝置可達到的實際最大分辨力。由于在FAIMS載氣中增加氦氣對于不同離子遷移率及結(jié)構(gòu)的影響可能存在差異，由此造成雙峰1、2間的重合度不斷提高，分辨率逐漸降低，示于圖5b。但該結(jié)果仍然說明，增加氦氣比例可顯著提高FAIMS的分辨力，且這一效果與已有研究[24]中提升FAIMS DV所產(chǎn)生的效果相同。證明在利用FAIMS對物質(zhì)進行分析時，可以通過同時增加氦氣比例及提高FAIMS DV等方式來提升FAIMS的整體分辨力。

圖5 蔗糖雙峰的分辨力(a)及分辨率(b)隨氦氣比例的變化曲線Fig.5 Variation curves of resolving power (a) and resolution (b) for sucrose sample with different He percentage

2.3 FAIMS對糖類同分異構(gòu)體的分離

為進一步分析FAIMS對二糖同分異構(gòu)體的分離效果，本文比較了純氮氣條件下10 mmol/L蔗糖和麥芽糖的譜圖，示于圖6。2種樣品的FAIMS譜圖存在相同的背景峰(圖2c中的峰3和峰4)；麥芽糖譜圖中最左側(cè)峰與圖2c中蔗糖雙峰1、2存在明顯差異。通過考察不同濃度的樣品實驗和離子質(zhì)荷比信息，推測差異峰分別是蔗糖和麥芽糖的FAIMS信號峰。其中，蔗糖峰1的CV絕對值最大，峰2的CV絕對值最小，麥芽糖介于二者之間。雖然蔗糖雙峰及麥芽糖譜峰的CV值存在一定差異，但3個譜峰高度重疊，難以實現(xiàn)有效的定性分析。

圖6 純氮氣下，蔗糖、麥芽糖溶液的FAIMS譜圖Fig.6 FAIMS spectrum of sucrose and maltose solutions with pure N2 as FAIMS carrier gas

為提高蔗糖、麥芽糖譜峰的分離度，在不同氦氣比例下采集麥芽糖的FAIMS譜圖，并利用分離算法提取2種二糖的譜峰，分離后的二糖信號示于圖7?？梢杂^察到，隨著氦氣比例增加，F(xiàn)AIMS的分辨力明顯提升，2種樣品對應(yīng)的CVP絕對值均顯著提升，但提升速度不同。根據(jù)圖4和圖7可知，當氦氣比例由0%增加到40%時，蔗糖峰1的CVP絕對值增加3.5 V，推測峰2增加超4 V，而麥芽糖僅增加2.7 V，這使蔗糖峰1和麥芽糖峰之間的分離度持續(xù)變高，而蔗糖峰2與麥芽糖峰的分離度先降低(氦氣比例0%～20%)后增高(氦氣比例20%～40%)。當氦氣比例達到40%時，由于蔗糖峰2被峰1覆蓋，導(dǎo)致蔗糖與麥芽糖均只存在單一峰，譜峰分布明顯簡化，分離效果明顯提升，2種物質(zhì)主峰的重合度由純氮氣時的77%降至50%，CV差值由1 V提升至1.8 V，分辨率由0.36提升至0.67。這一結(jié)果表明，在FAIMS載氣中添加氦氣不僅可提升FAIMS分辨力，還能夠更好地分離糖類同分異構(gòu)體。此外，F(xiàn)AIMS DV加熱可能不利于糖類離子結(jié)構(gòu)多樣性的研究，但在分析多種同分異構(gòu)體物質(zhì)時，能起到簡化譜峰分布、方便物質(zhì)定性分析的作用。

注：a.0%;b.10%;c.20%;d.30%;e.40%圖7 不同氦氣比例下，蔗糖、麥芽糖溶液的FAIMS譜圖Fig.7 FAIMS spectra of sucrose and maltose solutions with different He percentage

3 結(jié)論

本文研發(fā)了一款可獨立使用的新型FAIMS裝置用于分析糖類異構(gòu)體。該裝置由高分辨平板型FAIMS、零相位濾噪算法及基于二階導(dǎo)及改進粒子群算法的重疊峰分離算法組成，能夠在分離不同離子的同時過濾噪聲信號，并快速提取分析物譜峰，從而保證定性分析的準確性。同時，利用蔗糖和麥芽糖樣品系統(tǒng)性地研究了該裝置對糖類同分異構(gòu)體的分離效果。結(jié)果表明，相較于IMS，該FAIMS裝置對糖類離子的結(jié)構(gòu)差異更敏感，能夠分離出IMS無法識別的蔗糖離子結(jié)構(gòu)；當載氣為氮氣/氦氣的混合氣體時，F(xiàn)AIMS能實現(xiàn)蔗糖和麥芽糖離子的分離，通過將氦氣比例由0%提至40%，2種物質(zhì)的譜峰重疊度由77%降至50%，分離效果明顯提高。