索德成， 肖志明， 張 晶， 王 石， 馮玉超，3， 管 鑫，3， 李 陽(yáng)， 樊 霞*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建福州 350003；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163000）

椰毒假單胞菌是一種致死率很高的病原菌，此菌主要產(chǎn)生2種毒素：米酵菌酸（Bongkrekic acid）和毒黃素 （Toxoflavin）（田鳳麗等，2017；Buckle等，1990；Nugteren等，1957）。米酵菌酸可以與細(xì)胞中的線粒體ADP/ATP轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合，阻止ADP的轉(zhuǎn)移，并且其對(duì)人、動(dòng)物有毒性作用，可引起中毒性肝炎、中毒性腎病等，從而導(dǎo)致臟器損傷，動(dòng)物中毒癥狀為萎頓、豎毛、平衡障礙，瀕死時(shí)有抽搐等現(xiàn)象（劉瑩等，2003）。毒黃素可以直接作用與細(xì)胞內(nèi)的電子傳遞鏈，影響呼吸作用并產(chǎn)生大量的有毒的過(guò)氧化氫分子，對(duì)人、動(dòng)物皆有毒性作用，主要為急性中毒，中毒后會(huì)出現(xiàn)呼吸急而深，全身震顫、抽搐，血尿或血色素尿等現(xiàn)象 （翁晨輝等，2017；Hellendoorn等，1961），與米酵菌酸共同作用，可以引起細(xì)胞死亡。劉秀梅等（1991）從干玉米葉中分離到9株椰毒假單胞菌酵米面亞種，并在其產(chǎn)毒培養(yǎng)物中檢出米酵菌酸；趙晉等（1997）也從發(fā)酵玉米中檢出米酵菌酸。秸稈發(fā)酵飼料是以玉米、甜高粱等為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵加工而成的飼料，已廣泛應(yīng)用于反芻動(dòng)物的飼養(yǎng)中，在單胃動(dòng)物飼糧中也有一定的應(yīng)用（韓明鵬等，2010；楊永明等，2002）。因此對(duì)發(fā)酵飼料中米酵菌酸和黃毒素的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)估具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于米酵菌酸和黃毒素檢測(cè)方法大多集中于食品領(lǐng)域，包括生物傳感測(cè)定法、薄層色譜法、高效液相色譜法及高效液相色譜質(zhì)譜法等。生物傳感器法利用其β-半乳糖苷酶活性測(cè)定毒黃素濃度，抗干擾能力較弱，需要較好的凈化手段（劉倩妤等，2020；Choi等，2013）。薄層色譜法的前處理較為復(fù)雜、有機(jī)試劑的消耗量大、基質(zhì)干擾多、結(jié)果回收率低，不適用于批量樣品的檢測(cè)分析（Nugteren等，1957），國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.189修訂時(shí)刪除了薄層色譜法。液相色譜法因飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜所致，對(duì)前處理過(guò)程的要求較高，檢測(cè)限也較高，無(wú)法滿足痕量分析要求（沈?yàn)t冰等，2018；李紅艷等，2016；Voragen等，1982）。近年來(lái)，應(yīng)用LC-MS/MS進(jìn)行米酵菌酸和毒黃素檢測(cè)的研究日趨增多，配合簡(jiǎn)單的前處理過(guò)程即可滿足痕量檢測(cè)要求（王俊虎等，2020；Liang等，2021；曾令浩等，2019；周鵬，2015），但缺乏秸稈發(fā)酵飼料中米酵菌酸和毒黃素的同步分析方法。為此，本研究利用多重吸附前處理技術(shù)，配合液相色譜串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜，旨在建立同步檢測(cè)秸稈發(fā)酵飼料中米酵菌酸和毒黃素的方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑AB SCIEX Triple Quad 6500+型液相色譜串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司）：配有電噴霧電離源（ESI源），米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；黃毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：購(gòu)自美國(guó)Target Molecule公司；乙腈和甲醇：色譜純，購(gòu)自德國(guó)Fisher ChenAlert Guide公司；其他試劑：均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；試驗(yàn)用水：經(jīng)Milli-Q純化制備的一級(jí)水（＞18.2 MΩ）。0.22 μm尼龍濾膜：購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 前處理吸附材料：HLB填料購(gòu)自深圳逗點(diǎn)科技有限公司；Carb填料、Al-N填料、C18填料購(gòu)自天津博納艾杰爾科技公司；PSA填料、Carb填料、SCX填料、SAX填料購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司；納米碳（Nano Carb）（粒徑10～20 nm）購(gòu)自先鋒納米有限公司。具體材料類(lèi)型等相關(guān)信息參見(jiàn)表1。

表1 吸附材料名稱與類(lèi)型

多重吸附前處理吸附材料的制備：稱取2 g HLB填料和3 g Al-N填料于50 mL三角瓶中，混合均勻，備用。

實(shí)驗(yàn)用秸稈發(fā)酵飼料樣品由國(guó)家飼料質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（北京）提供，采集于使用秸稈發(fā)酵飼料的養(yǎng)殖場(chǎng)或生產(chǎn)企業(yè)。

1.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取2 g秸稈發(fā)酵飼料樣品（精確至0.01 g），加入20 mL 1%甲酸溶液+乙腈溶液（15+85），振蕩提取30 min，于10000 r/min條件下離心5 min，取上清液備用。

移取3 mL上清液，置于10 mL離心管中，加入100 mg多重吸附前處理吸附材料和500 mg無(wú)水硫酸鎂，漩渦混合30 s，于10000 r/min條件下離心2 min；將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，在40℃溫度下用氮?dú)獯抵两?，加?.5 mL乙腈+0.1%甲酸水溶液（10+90），漩渦混合30 s，過(guò)0.22 μm濾膜，上液相色譜串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相流速：0.3 mL/min，梯度淋洗。流動(dòng)相組成及洗脫梯度條件見(jiàn)表2。質(zhì)譜采用電噴霧電離源（ESI）正負(fù)離子切換模式進(jìn)行分段采集，0～3 min為正離子檢測(cè)模式，用于測(cè)定毒黃素；3～5 min采用負(fù)離子模式，用于測(cè)定米酵菌酸。噴霧電壓為4.5 kV；毛細(xì)管溫度為420℃；脫溶劑氣和碰撞氣均為高純氮?dú)?，氣量分別為50 arb和30 arb。具體參數(shù)見(jiàn)表3。

表2 流動(dòng)相梯度條件

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化 用微量注射泵直接將米酵菌酸和毒黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）注入質(zhì)譜儀，分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，以確定米酵菌酸和毒黃素的分子離子峰，米酵菌酸在負(fù)離子模式下有很高的響應(yīng)值，其主要的分子離子峰為[M-H]－；毒黃素在正離子模式下響應(yīng)值高，其主要的分子離子峰為[M+H]+。分別在各自的檢測(cè)模式下對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，獲得二級(jí)質(zhì)譜響應(yīng)較強(qiáng)的子離子；然后進(jìn)行優(yōu)化，獲得去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）等相關(guān)參數(shù)，具體參數(shù)參見(jiàn)表3。

表3 米酵菌酸和毒黃素的質(zhì)譜條件

目前，采取液相色譜檢測(cè)米酵菌酸和毒黃素的報(bào)道中多數(shù)采用以甲酸或乙酸水溶液為水相，以甲醇或乙腈為有機(jī)相的基本流動(dòng)相條件。為此，本實(shí)驗(yàn)參考上述流動(dòng)相條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明，使用0.1%甲酸乙腈溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，待測(cè)物質(zhì)的色譜峰型和出峰穩(wěn)定性較好，可以在6 min內(nèi)有效分離2種目標(biāo)化合物，節(jié)省了溶劑消耗，降低了分析成本和廢液產(chǎn)生。具體色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 米酵菌酸和毒黃素定量離子色譜圖

2.2 提取條件選擇 米酵菌酸和黃毒素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異較大。米酵菌酸是一種脂類(lèi)毒素，易溶于有機(jī)溶劑中（方力等，2022）；毒黃素屬水溶性黃色素，不溶于石油醚、乙醚和二甲苯等有機(jī)溶劑中，但在甲醇、乙腈、氯仿、二甲基亞砜具有一定的溶解性。本實(shí)驗(yàn)以秸稈發(fā)酵飼料為基質(zhì)，考察了甲醇、乙腈、氯仿、二甲基亞砜、乙腈+甲酸溶液、乙腈+氨水溶液、乙腈+水溶液的提取效果。實(shí)驗(yàn)時(shí)，稱取空白秸稈發(fā)酵飼料2 g，加入0.1 mL 1 μg/mL米酵菌酸與毒黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入20 mL不同類(lèi)型的提取溶劑，漩渦振蕩提取30 min，在10000 r/min條件下離心5 min。取上清液過(guò)膜，上機(jī)檢測(cè)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算回收率。分析結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同溶液提取秸稈發(fā)酵飼料中米酵菌酸和黃毒素的效果對(duì)比

由圖2可知，甲醇有較好的提取能力，但也同時(shí)存在會(huì)萃取出多種其他成分而產(chǎn)生基質(zhì)干擾的情況，不利于下一步凈化。二甲基亞砜提取時(shí)，提取液中含有大量蛋白和色素等雜質(zhì)，影響定性與定量的效果；同時(shí)污染色譜柱，結(jié)果回收率較低。氯仿對(duì)毒黃素的提取效果較好，但是對(duì)米酵菌酸的提取效果較差。乙腈對(duì)兩種毒素均有較好的提取能力，因此選用乙腈作為有機(jī)萃取劑。為了進(jìn)一步提高回收率，適量加入甲酸或氨水溶液，加入一定比例的水溶液后，毒黃素和米酵菌酸的回收率可以達(dá)到80%以上，原因可能是毒黃素的水溶解性強(qiáng)、水能有效提取秸稈發(fā)酵飼料中毒黃素，同時(shí)水能提高有機(jī)溶劑對(duì)米酵菌酸的滲透性，從而提高對(duì)米酵菌酸提取效率（方力等，2022）。采用乙腈+氨水提取時(shí)，目標(biāo)物米酵菌酸與溶劑中的NH4+離子結(jié)合，導(dǎo)致回收率降低。采用乙腈+甲酸溶液作為提取劑時(shí)，毒黃素和米酵菌酸的回收率均可以達(dá)到80%以上。綜合以上分析，本研究最終選擇20 mL 1%甲酸溶液+乙腈（15+85）溶液作為提取溶液。

2.3 多重機(jī)制雜質(zhì)吸附凈化的條件選擇 目前常用固相萃取柱和QuEChERS凈化米酵菌酸或毒黃素（Liang，2021；周鵬，2015），然而由于毒黃素分子質(zhì)量小，研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)無(wú)法使用固相萃取柱進(jìn)行有效富集和凈化，同時(shí)常用的QuECh-ERS材料如PSA、C18對(duì)在秸稈發(fā)酵飼料樣品的凈化效果一般，需要找到或研發(fā)新的填料用于米酵菌酸或毒黃素的凈化去除雜質(zhì)。為此，本研究中選擇10種常見(jiàn)的不同凈化填料，探索對(duì)秸稈發(fā)酵飼料中米酵菌酸或毒黃素的凈化回收效果。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：稱取空白秸稈發(fā)酵飼料20 g，加入200 mL 1%甲酸溶液+乙腈溶液（15+85），振蕩提取30 min，在10000 r/min條件下離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至試劑瓶中備用。分別吸取3 mL提取液，加入0.3 mL 1 μg/mL米酵菌酸與毒黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別加入100 mg各種吸附材料，漩渦混合30 s，在搖床上振蕩15 min，10000 r/min條件下離心5 min，取上清液過(guò)膜，上機(jī)檢測(cè)；同時(shí)吸取3 mL提取液，不加入吸附材料作為空白參考。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用測(cè)定值與空白參考比值計(jì)算回收率，并以此比較吸附效果，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同吸附劑對(duì)米酵菌酸與毒黃素吸附能力比較

從圖3可以看出，吸附材料能吸附部分干擾物質(zhì)，降低了樣品的基質(zhì)效應(yīng)，使處理后回收率高于空白提取液；但FL吸附材料對(duì)米酵菌酸有明顯的富集作用（回收率＞100%），但對(duì)毒黃素吸附率不到50%，不宜作為富集材料使用；而使用HLB填料和Al-N填料進(jìn)行吸附后，檢測(cè)結(jié)果具有較好的回收率。其中，HLB填料是親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，親脂性的二乙烯基苯結(jié)構(gòu)保留非極性化合物，親水性的N-乙烯基吡咯烷酮結(jié)構(gòu)保留極性化合物，使得該填料具有良好的吸附雜質(zhì)性能；Al-N填料為中性氧化鋁，主要作用機(jī)理為物理吸附，可去除部分重金屬、部分色素和酯類(lèi)物質(zhì)。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論分析，選擇HLB和Al-N作為多重機(jī)制雜質(zhì)吸附的組成材料，通過(guò)混合使用，可以有效的去除秸稈發(fā)酵飼料提取液中的各種雜質(zhì)干擾，達(dá)到更好的凈化效果。因此，本研究最終采用多重機(jī)制雜質(zhì)吸附技術(shù)（MIA）來(lái)凈化樣品。將各種材料按不同比例添加進(jìn)行凈化研究，從基質(zhì)凈化效果來(lái)看，HLB和Al-N的比例為1:1，能有效地吸附雜質(zhì)，從而降低基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)加入吸附劑吸附凈化后，在有效地除去基質(zhì)中的干擾物對(duì)待測(cè)物色譜峰的影響的同時(shí)，還可以減少雜質(zhì)對(duì)儀器和色譜柱的損害。

在此基礎(chǔ)上，本研究考察了吸附材料的不同使用量對(duì)樣品凈化效果的影響，比較了不同固體吸附劑添加量（10、20、50、100、200、500 mg）對(duì)秸稈發(fā)酵飼料提取液中雜質(zhì)凈化效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)固體吸附材料加入量達(dá)100 mg時(shí)，溶液色澤明顯變淺；但繼續(xù)加大吸附劑的用量，對(duì)秸稈發(fā)酵飼料樣品雜質(zhì)的凈化效果無(wú)明顯改善。因此，將吸附材料加入量設(shè)定為100 mg。

2.4 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和檢出限，定量限不同秸稈發(fā)酵飼料樣品的組成比較復(fù)雜，使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)時(shí)基質(zhì)干擾非常明顯，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系進(jìn)行研究時(shí)，需針對(duì)特定基質(zhì)進(jìn)行。取空白秸稈發(fā)酵飼料樣品進(jìn)行前處理，以此基質(zhì)提取液作稀釋液配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，與直接用定容液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比，結(jié)果毒黃素呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，米酵菌酸無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)。為消除基質(zhì)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)繪制基質(zhì)校正標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行定量。取空白樣品進(jìn)行前處理后，配制米酵菌酸與毒黃素濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子色譜峰面積與基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.0～100 μg/L內(nèi)線性關(guān)系良好。設(shè)定定量離子色譜峰的3倍信噪比（S/N）為檢出限（LOD），10倍S/N為定量限（LOQ），得出米酵菌酸與毒黃素的LOD和LOQ。

表4 米酵菌酸與毒黃素線性方程、LOQ和LOQ

2.5 回收率和精密度 稱取2 g空白樣品，添加適量米酵菌酸與毒黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備米酵菌酸與毒黃素添加水平分別為5、100、1000 μg/kg的秸稈發(fā)酵飼料樣品，每個(gè)添加水平制備18份樣品，按本研究建立的方法，每天測(cè)定6份，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算其日內(nèi)和日間回收率，及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，本方法回收率為82.8%～102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15.0%，滿足飼料分析方法的要求。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè) 按上述方法對(duì)50份秸稈發(fā)酵飼料樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中6份樣品中檢出米酵菌酸或毒黃素，其中米酵菌酸含量為3.5～56.7 μg/kg，毒黃素含量為5.3～14.6 μg/kg，其含量差異比較明顯，部分秸稈發(fā)酵飼料樣品中2種毒素同時(shí)有檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了利用多重吸附技術(shù)結(jié)合液相色譜串聯(lián)四極桿線性離子阱質(zhì)譜（LC-MS/MSQTRAP）測(cè)定秸稈發(fā)酵飼料中米酵菌酸和毒黃素含量的方法。該方法前處理簡(jiǎn)單，線性良好，回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、方法檢出限、方法定量限均能滿足秸稈發(fā)酵飼料中毒素含量檢測(cè)的要求。采用建立的方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，部分秸稈發(fā)酵飼料中檢出米酵菌酸和毒黃素，結(jié)果表明，秸稈發(fā)酵飼料中米酵菌酸和毒黃素存在安全風(fēng)險(xiǎn)的情況，應(yīng)盡快制定相應(yīng)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和限量要求，防止因動(dòng)物飼料傳遞造成的畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。