孫尹雙，陳甜甜，白冬紅，辛國芹，汪祥燕，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271000）

抗生素長(zhǎng)期、大量使用，其弊端日益凸顯，例如：病原菌耐藥性的產(chǎn)生、畜禽腸道微生態(tài)紊亂及免疫力下降、抗生素殘留等，嚴(yán)重制約畜牧業(yè)的持續(xù)、健康發(fā)展，很多國家已經(jīng)明確禁止使用飼用抗生素（竇茂鑫等，2013）。因此，尋找安全、有效的新型綠色飼料添加劑迫在眉睫。飼用微生態(tài)制劑作為飼料添加劑，一方面能夠通過產(chǎn)生復(fù)合酶系分解糖類、蛋白質(zhì)、纖維素等物質(zhì)，從而提高飼料利用率，同時(shí)還能維持動(dòng)物腸道微生態(tài)的穩(wěn)態(tài)，抑制病原菌的生長(zhǎng)與繁殖，提升動(dòng)物的免疫力等（Abd等，2020）。有研究表明，在日糧中添加微生態(tài)制劑不僅能夠提升豬的免疫力、生長(zhǎng)性能，還能夠減少有害氣體的排放（Lei等，2014）。隨著研究的不斷深入，以有益微生物開發(fā)的動(dòng)物微生態(tài)制劑已被養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)接受并廣泛使用（張?jiān)鲂l(wèi)，2013）。

動(dòng)物微生態(tài)制劑開發(fā)的核心是優(yōu)良菌種的選育。理想的生產(chǎn)菌種應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：（1）安全性好，對(duì)宿主、環(huán)境無害；（2）能夠在消化道、腸道定植；（3）功能明確，能夠產(chǎn)生有益物質(zhì)，如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等；（4）能夠抑制病原菌；（5）穩(wěn)定性好，加工及貯存過程中能夠保持活性（趙述淼，2009）。目前用于開發(fā)動(dòng)物微生態(tài)制劑的菌種主要是芽孢桿菌（Bacillus）和乳酸菌（Lactobacillus）等。與其他類型的益生菌相比，芽孢桿菌由于其功能突出、抗逆性強(qiáng)、生產(chǎn)及貯藏性能好而具有廣闊的開發(fā)及應(yīng)用前景（張新雄等，2013）。本研究以健康高產(chǎn)奶牛瘤胃液為篩選源，旨在篩選出產(chǎn)酶性能和抑菌性能優(yōu)良的菌株，為飼用芽孢桿菌奶牛微生態(tài)制劑的研究和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 瘤胃液的采集 于晨飼前從健康高產(chǎn)奶牛采集瘤胃液，通過4層紗布過濾，置于39℃保溫瓶中，立即蓋嚴(yán)瓶口并轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室保溫存放。

1.1.2 培養(yǎng)基NA（Nutrient Agar）固體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉粉0.3%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.5%～2%，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基：蛋白胨1.0%，氯化鈉0.5%，酵母膏0.5%，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。大豆胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）：胰蛋白胨1.5%，大豆胨0.5%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.3%，pH 7.3～7.5。

1.1.3 供試病原菌 大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和傷寒沙門氏菌（Salmonella trphimurium）均由山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏并提供。

1.2 方法

1.2.1 瘤胃液中芽孢桿菌的分離 將新鮮瘤胃液取出后充分混勻，吸取10 mL置于裝有90 mL無菌水的錐形瓶中，80℃水浴15 min殺滅非芽孢菌；按照梯度稀釋法將加熱處理后的瘤胃液稀釋至10-7；分別吸取10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液均勻涂布于NA固體培養(yǎng)基表面，每個(gè)稀釋度3個(gè)平板。37℃培養(yǎng)24 h后，根據(jù)菌落形態(tài)特征區(qū)分，挑取形態(tài)差異的單菌落進(jìn)行純化并保藏（Wang等，2021）。

1.2.2 產(chǎn)酶活性測(cè)定 纖維素酶活測(cè)定：采用CMC糖化力法對(duì)各菌株發(fā)酵液中纖維素酶活力進(jìn)行測(cè)定（李蘭曉等，2006）。纖維素酶活力單位定義為1 mL酶液在40℃、pH 4.6條件下，每分鐘水解羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）產(chǎn)生1.0 μg葡萄糖，即為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示（蛋白酶活力測(cè)定法SB/T 10317-1999）。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

蛋白酶活力測(cè)定：測(cè)定方法參照中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T10317-1999中的福林法（蛋白酶活力測(cè)定法SB/T 10317-1999）。酶活定義單位為1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位（U/mL）。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

α-淀粉酶活力測(cè)定：參照測(cè)試盒使用說明書（C106-1-1，南京建成生物工程研究所）采用淀粉-碘比色法測(cè)定各菌株的α-淀粉酶活力。酶活單位定義為100 mL上清液中的淀粉酶，在37℃與底物作用30 min，水解100 mg淀粉為1個(gè)單位（U/100 mL）。

1.2.3 抑菌活性測(cè)定 病原菌指示菌菌液制備：取斜面保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌于NA固體培養(yǎng)基劃線，37℃活化12 h；挑取單菌落接種至裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中經(jīng)37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；通過稀釋涂布法計(jì)數(shù)并將各病原指示菌的濃度調(diào)節(jié)為1×107cfu/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

芽孢桿菌發(fā)酵上清液的制備：取斜面保存的芽孢桿菌菌株于NA固體培養(yǎng)基劃線，37℃活化12 h；挑取單菌落接種至裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中經(jīng)37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h制備種子液；按1%體積的接種量接種于裝有50 mL的LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中經(jīng)37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h制備發(fā)酵液；發(fā)酵液經(jīng)4℃、12000 r/min離心10 min后棄去菌體，吸取上清液過0.22 μm無菌濾膜后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

抑菌試驗(yàn)：分別吸取100 μL各病原指示菌菌液，均勻涂布于NA固體平板上；用無菌鑷子將牛津杯放置在平板上；向牛津杯中加入200 μL發(fā)酵上清液，處理完成后小心將平板轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。以無菌LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，試驗(yàn)共重復(fù)3次，每次3個(gè)平行。

1.2.4 菌種鑒定 菌株的生理生化采用Biolog-GEN-III微孔板法進(jìn)行鑒定：將與NA固體培養(yǎng)基活化12 h的菌株接種于TSA固體培養(yǎng)基，33℃培養(yǎng)16 h后用無菌一次性棉簽沾取單菌落接種于IF-B接種液中，攪拌均勻并用濁度計(jì)調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為90%～98%T。將菌懸液倒入無菌的V型槽中，并用移液器轉(zhuǎn)移至微孔板，每孔100 μL。將微孔板在33℃培養(yǎng)24 h后，采用MicroStation自動(dòng)微生物鑒定分析系統(tǒng)分析菌株生理生化特征并于標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)（Li等，2019）。分子生物學(xué)鑒定：將菌株于NA固體培養(yǎng)基活化12 h后，挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h后獲得菌懸液。參照試劑盒（CW0552，康為世紀(jì)）使用說明收集菌體并提取細(xì)菌基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）及1492R（5′-ACGGCTACCTTGTTACGCTT-3′）進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（王建宇等，2021）。擴(kuò)增體系為25 μL，其中基因組DNA模板2 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，2×Easy-TaqRPCR SuperMix（AS111，北京全式金生物）12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，共34個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后委托上海生工生物工程股份有限公司完成測(cè)序，將獲得的序列在NCBI上BLAST比對(duì)并用Mega 6.0軟件進(jìn)行聚類分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)1000次進(jìn)行自展值分析（王建宇等，2021）。

2 結(jié)果

2.1 菌種篩選 通過純培養(yǎng)的方法，根據(jù)菌落形態(tài)區(qū)分，結(jié)合菌體產(chǎn)芽孢的鏡檢結(jié)果，從健康奶牛瘤胃樣品中共分離獲得22株芽孢桿菌，編號(hào)如表1所示。

2.2 產(chǎn)酶活性 對(duì)分離得到的22株芽孢桿菌的產(chǎn)酶活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明具有產(chǎn)纖維素酶活性的菌株有15株，產(chǎn)蛋白酶活性的菌株有17株，所有分離菌株均有產(chǎn)淀粉酶活性，能夠同時(shí)產(chǎn)三種酶的菌株有12株；其中芽孢桿菌BX1-12產(chǎn)酶活性最高，其纖維素酶、蛋白酶及淀粉酶活性分別為27.33、137.54 U/mL以及1450.53 U/100 mL（表1）。

表1 22株芽孢桿菌產(chǎn)酶活性

2.3 抑菌活性 由表2可知，22株芽孢桿菌均具有一定的抑菌活性，能夠抑制大腸桿菌的菌株有12株，其中S2Y-5活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為18.02 mm；13株菌具有拮抗金黃色葡萄球菌活性，15株菌能夠抑制傷寒沙門氏菌，其中芽孢桿菌BX1-12對(duì)兩種病原菌的抑制活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別為23.21、25.97 mm。此外，BX1-12對(duì)大腸桿菌也具有抑制效果，表現(xiàn)出廣譜的抗菌性。

表2 22株芽孢桿菌對(duì)三種病原指示菌的抑菌圈直徑mm

2.4 芽孢桿菌BX1-12鑒定

2.4.1 生理生化鑒定 綜合產(chǎn)酶及抑菌活性，對(duì)菌株BX1-12進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定。部分Biolog生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，該菌株能夠利用蔗糖、糊精、D-纖維二糖、D-半乳糖、龍膽二糖、L-天冬氨酸等生長(zhǎng)因子；化學(xué)敏感試驗(yàn)中，菌株能夠耐受四唑紫、溴酸鈉、1%乳酸鈉、氯化鋰、4% NaCl等物質(zhì)。經(jīng)Biolog-GEN-III微孔板法鑒定，該菌與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）相似度最高。

表3 芽孢桿菌BX1-12生理生化測(cè)定結(jié)果

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定 將菌株BX1-12 16S rRNA序 列在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行同源性比較并構(gòu)建了菌株的Neighbor-Joining進(jìn)化樹。結(jié)果如圖1所示，該菌與枯草芽孢 桿 菌 （Bacillus subtilis）DSM 22148T（HE582781）同源性為97%。結(jié)合Biolog生理生化特性，該菌株經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌。

圖1 基于16S rRNA序列采用鄰接法構(gòu)建菌株BX1-12以及其他相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

芽孢桿菌是自然界中常見的一種微生物，由于其抗逆性強(qiáng)、功能多樣、產(chǎn)業(yè)化性能好等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)、種植業(yè)等領(lǐng)域（龔慧等，2014）。目前，常見的作為飼料添加劑使用的芽孢桿菌的種類主要有枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌等，其中枯草芽孢桿菌是目前研究、應(yīng)用最多的菌種之一，同時(shí)也是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部許可使用的安全菌株（成廷水等，2012）。例如，林顯華等（2013）發(fā)現(xiàn)在飼料中添加枯草芽孢桿菌B7能夠使肉雞增重，并改善肉雞機(jī)體免疫力。

雖然枯草芽孢桿菌的功能在養(yǎng)殖業(yè)中已得到廣泛認(rèn)可，但多集中在雞和豬的應(yīng)用上，在反芻動(dòng)物養(yǎng)殖上的研究相對(duì)較少（郝生宏等，2015）。此外，動(dòng)物微生態(tài)制劑能否發(fā)揮作用很大程度上取決于其在動(dòng)物胃腸道中的定植量，而宿主的生理?xiàng)l件通常會(huì)影響菌種的增殖（張新雄等，2013）?；诖?，本研究以原位篩選為原則，從健康奶牛瘤胃液中共分離得到22株芽孢桿菌，為奶牛用微生態(tài)制劑開發(fā)積累了重要的菌種資源。

飼用微生態(tài)制劑主要的功能之一是能夠合成并分泌纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等酶類，從而促進(jìn)飼料的消化吸收，減少畜禽因消化不良引起的腹瀉，此外，功能菌種還能夠抑制病原菌，提升畜禽的抵抗力（張吉鹍等，2019）。本研究系統(tǒng)評(píng)價(jià)了22株芽孢桿菌的產(chǎn)酶、抑菌活性并從中發(fā)現(xiàn)一株枯草芽孢桿菌BX1-12，該菌具有高產(chǎn)酶活及廣譜抑菌活性，應(yīng)用潛力較好，因此如何將該菌開發(fā)成為飼用微生態(tài)制劑是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以健康高產(chǎn)奶牛瘤胃液為研究對(duì)象，以產(chǎn)酶（纖維素酶、α-淀粉酶、蛋白酶）、抑菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌）活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，獲得了一株能夠高效產(chǎn)酶及廣譜抑菌的芽孢桿菌，編號(hào)為BX1-12，經(jīng)鑒定該菌為枯草芽孢桿菌，并為飼用芽孢桿菌奶牛微生態(tài)制劑的研究和開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，積累了寶貴的菌種資源。