于宗良，李曉雅，2，張曉囡，馬 鶴，2，王澤平，2，吳 敏，劉龍濤

原發(fā)性高血壓是以體循環(huán)動脈壓升高為主要臨床表現(xiàn)的心血管疾病，常可造成多個靶器官損傷，并發(fā)冠心病、糖尿病等慢性疾病，是急性腦血管事件的獨立危險因素之一[1]。近年來，隨著人們生活方式的變化，我國高血壓發(fā)病率呈逐年上升趨勢，根據(jù)《中國心血管病報告2018》測算，我國高血壓病人約2.45億人，成年人高血壓患病率高達27.9%，而控制率僅為16.8%[2-3]。原發(fā)性高血壓的具體發(fā)病機制尚不完全清楚，目前無根治措施，主要以穩(wěn)定降壓、減少并發(fā)癥發(fā)生為主要目的[4]。中醫(yī)藥作為聯(lián)合治療原發(fā)性高血壓的重要手段，能夠多靶點、多通路發(fā)揮降壓作用，對于防止靶器官損害具有獨特優(yōu)勢[5-7]。清眩降壓湯由苦丁茶、天麻、鉤藤、桑葉、菊花、黃芩、夜交藤、杜仲、生地黃、牛膝十味藥物組成，是陳可冀院士治療原發(fā)性高血壓的數(shù)十年的經(jīng)驗總結(jié)，臨床應(yīng)用效果確切。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，探究清眩降壓湯治療原發(fā)性高血壓的關(guān)鍵靶點和通路，為進一步研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 清眩降壓湯相關(guān)靶點篩選 以苦丁茶、天麻、鉤藤、桑葉、菊花、黃芩、夜交藤、杜仲、生地黃、牛膝為關(guān)鍵詞檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18的2個藥物動力學(xué)參數(shù)進行篩選以獲得活性成分。檢索中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)、傳統(tǒng)中藥百科全書數(shù)據(jù)庫(ETCM)挖掘藥物成分數(shù)據(jù)及已發(fā)表的相關(guān)文獻中研究較為成熟但參數(shù)未達到要求的活性成分，統(tǒng)一在TCMSP平臺檢索活性成分蛋白質(zhì)靶點。根據(jù)已發(fā)表的文獻補充未預(yù)測的活性成分已知靶點，并在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對靶點進行規(guī)范。

1.2 原發(fā)性高血壓相關(guān)靶點篩選 以hypertension、essential hypertension、spontaneous hypertension等關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫中治療原發(fā)性高血壓的潛在靶點，根據(jù)經(jīng)驗設(shè)定Score值排序前1/4的目標靶點為原發(fā)性高血壓潛在靶點，并通過OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫及DrugBank數(shù)據(jù)庫進行補充[8]。合并4個數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復(fù)值，獲得原發(fā)性高血壓相關(guān)靶點。

1.3 清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny 2.1將清眩降壓湯中藥作用靶點與原發(fā)性高血壓靶點取交集并繪制韋恩圖，得到清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓共同靶點。將交集靶點提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI模型，生物種類設(shè)為“Homo sapiens”，最小作用閾值設(shè)定為“highest confidence”(>0.9)，假陽性率(FDR)嚴格設(shè)定為“high”(<1%)，其余設(shè)置默認，得到PPI網(wǎng)絡(luò)[9]，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。

1.4 清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓靶點功能與通路的富集分析 將清眩降壓湯調(diào)節(jié)原發(fā)性高血壓的靶點錄入Metascape平臺[10-11]，設(shè)置P<0.01，分析其主要的生物學(xué)過程與代謝通路并進行富集分析，通過Bioinformatics平臺實現(xiàn)可視化。

1.5 清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape 3.7.2內(nèi)置工具分析有效成分、靶點和通路的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)，并分析核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分。

1.6 分子對接驗證 選取Cytoscape 3.7.2分析結(jié)果度值排名前10位的活性成分和靶點進行分子對接驗證。PubChem和PDB平臺獲取小分子配體和蛋白受體，以分辨率高和參考文獻支持為篩選條件。通過ChemOffice對小分子配體能量最小化處理，通過PyMOL對蛋白配體進行移除水分子、小分子配體，AutoDockTools加氫、計算電荷并設(shè)置為剛性分子。選中所有活性位點，通過AutoDockTools設(shè)置對接盒子進行分子對接[12]，OpenBabel實現(xiàn)可視化，最后通過PLIP平臺確定結(jié)合位點并可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 清眩降壓湯相關(guān)靶點篩選 篩選后共獲得苦丁茶活性成分11種、天麻活性成分13種、鉤藤活性成分37種、桑葉活性成分33種、菊花活性成分26種、黃芩活性成分37種、夜交藤活性成分14種、杜仲活性成分33種、生地黃活性成分19種、牛膝活性成分23種，各中藥重復(fù)成分見圖1，合并后刪除重復(fù)值，得到活性成分共計199種。苦丁茶作用靶點148個，天麻作用靶點41個，鉤藤作用靶點176個，桑葉作用靶點191個，菊花作用靶點206個，黃芩作用靶點90個，夜交藤作用靶點153個，杜仲作用靶點170個，生地黃作用靶點49個，牛膝作用靶點173個，合并后刪除重復(fù)值，得到靶點共計281個。

圖1 清眩降壓湯不同中藥重復(fù)成分統(tǒng)計

2.2 原發(fā)性高血壓相關(guān)靶點篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫得到原發(fā)性高血壓相關(guān)靶點6 972個，根據(jù)經(jīng)驗設(shè)定Score值前1/4的目標靶點為原發(fā)性高血壓潛在靶點。結(jié)合OMIM、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，合并后刪除重復(fù)值，最終得到1 775個原發(fā)性高血壓相關(guān)靶點。

2.3 清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Venny 2.1將清眩降壓湯活性成分作用靶點與原發(fā)性高血壓靶點取交集并繪制韋恩圖，得到清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓共同靶點173個，詳見圖2。通過STRING 11.0平臺構(gòu)建蛋白互作模型，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建，清除游離節(jié)點，共形成點154個、邊728條，平均點度值8.42，平均聚類系數(shù)0.45，圖3展示度值大于20的節(jié)點網(wǎng)絡(luò)。

圖2 清眩降壓湯-原發(fā)性高血壓作用靶點韋恩圖

圖3 清眩降壓湯-原發(fā)性高血壓靶點PPI網(wǎng)絡(luò)(度值>20)(節(jié)點面積越大、顏色越深表示度值越大，提示節(jié)點越重要)

2.4 清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓靶點功能與通路的富集分析 基因本體(GO)功能富集分析得到條目2 705個，其中生物過程(BP)條目2 391個，細胞組成(CC)條目120個，分子功能(MF)條目194個，分別占88.4%、4.4%、7.2%，詳見圖4。京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集篩選得到355條信號通路(見圖5)。清眩降壓湯成分參與的BP主要包括血管發(fā)育、對細胞外刺激的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對細胞運動的正向調(diào)節(jié)等。MF主要包括蛋白質(zhì)均二聚活性、氧化還原酶活性、腎上腺素能受體活性、脂質(zhì)結(jié)合、輔因子結(jié)合等。參與的相關(guān)通路主要有絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路等，富集結(jié)果前20位相關(guān)靶點通路見表1。

表1 清眩降壓湯調(diào)節(jié)原發(fā)性高血壓通路富集分析

2.5 清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.2構(gòu)建清眩降壓湯成分-原發(fā)性高血壓靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，圖6展示了度值排名前5%的活性成分、靶點和通路網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)分析顯示，槲皮素度值為92，介度為0.194，緊密度為0.487，預(yù)測槲皮素可能為清眩降壓湯治療原發(fā)性高血壓的主要活性成分，其次為芹菜素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素和大黃素等，詳見表2。PTGS2在網(wǎng)絡(luò)中度值為125，介度為0.227，緊密度為0.497，預(yù)測PTGS2為清眩降壓湯治療原發(fā)性高血壓的最重要靶點。環(huán)加氧酶1(PTGS1)、雄激素受體(AR)、MAPK1、MAPK3、AKT1、一氧化氮合酶2(NOS2)、PRKCA、MAPK14、RELA等亦為相對重要的靶點，詳見表3。

圖6 清眩降壓湯活性成分-原發(fā)性高血壓靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖(度值排名前5%)(藍紫色節(jié)點代表作用靶點，粉色節(jié)點代表通路，淡紅色節(jié)點代表活性成分，節(jié)點面積代表度值，面積越大說明節(jié)點越重要)

表2 清眩降壓湯主要活性成分藥物特征及網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

表3 清眩降壓湯主要成分靶點網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

2.6 分子對接驗證 根據(jù)度值，選取排名前10位的活性成分與靶點進行分子對接驗證，結(jié)合能越低，分子結(jié)合越穩(wěn)定，對接效果越好，一般認為結(jié)合能低于-29.3 kJ/mol提示對接穩(wěn)定。如圖7所示，槲皮素、山奈酚、木犀草素與排名前10位的靶點均對接良好。大黃素與MAPK3、RELA結(jié)合能低于-41.8 kJ/mol，為對接效果最好的活性成分與靶點，其次為木犀草素與PTGS1、槲皮素與PTGS2，以及山奈酚與PTGS2，對接結(jié)合能均低于-39.7 kJ/mol。針對對接效果最好的五對分子-靶點對接進行可視化處理，可以看出結(jié)合以疏水鍵的相互作用和氫鍵為主，與在大黃素與RELA、木犀草素與PTGS1的對接中還存在π堆積作用，詳見圖8。

圖7 清眩降壓湯活性成分-原發(fā)性高血壓靶點分析對接聚類熱圖

圖8 清眩降壓湯活性成分-原發(fā)性高血壓靶點分子對接及對接位點示意圖(A為大黃素與MAPK3對接結(jié)果；B為大黃素與RELA對接結(jié)果；C為木犀草素與PTGS1對接結(jié)果；D為槲皮素與PTGS2對接結(jié)果；E為山奈酚與PTGS2對接結(jié)果)

3 討 論

原發(fā)性高血壓發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且病人依從性差、疾病控制率低，常可導(dǎo)致多種急性并發(fā)癥，嚴重威脅公眾健康[13]。中藥聯(lián)合治療高血壓能夠有效提高血壓控制率，在改善癥狀、減少并發(fā)癥方面具有獨特優(yōu)勢[14]。清眩降壓湯由苦丁茶、天麻、鉤藤、桑葉、菊花、黃芩、夜交藤、杜仲、生地黃、牛膝十味藥物組成，是陳可冀院士治療原發(fā)性高血壓的經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用效果確切。臨床研究證實，聯(lián)合使用清眩降壓湯能夠有效降低原發(fā)性高血壓病人全天收縮壓和舒張壓，顯著降低中醫(yī)證候積分，治療肝陽上亢型、肝腎陰虛型原發(fā)性高血壓療效顯著[15-16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，清眩降壓湯在治療圍絕經(jīng)期原發(fā)性高血壓、青年高血壓及老年高血壓方面同樣可以發(fā)揮良好效果，能夠有效改善病人癥狀，降低中醫(yī)證候評分及血清血管緊張素Ⅱ、同型半胱氨酸水平[17-19]。由此可見，清眩降壓湯治療原發(fā)性高血壓證型廣泛，臨床效果確切。大量實驗研究對清眩降壓湯生物學(xué)機制進行了探討。如林珊等[20]采用大鼠離體胸主動脈環(huán)進行研究證實，清眩降壓湯能夠有效舒張血管，明顯降低離體血管環(huán)收縮力。而在體實驗研究則發(fā)現(xiàn)，清眩降壓湯能夠有效控制自發(fā)性高血壓模型大鼠血壓的進一步升高，減小血管中膜厚度，改善血壓升高導(dǎo)致的動脈血管重構(gòu)，其機制與降低Bcl-2蛋白表達、抑制血管平滑肌細胞增殖有關(guān)[21]。類似的研究則認為，清眩降壓湯逆轉(zhuǎn)自發(fā)性高血壓大鼠血管重塑的機制可能與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)/Smad通路及誘導(dǎo)血管平滑肌細胞凋亡有關(guān)[22-23]。整體而言，清眩降壓湯治療原發(fā)性高血壓臨床效果顯著，其改善血管重構(gòu)的機制主要與調(diào)節(jié)平滑肌細胞增殖與凋亡有關(guān)，而針對清眩降壓湯的降壓機制仍有待深入研究。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步篩選出清眩降壓湯調(diào)節(jié)原發(fā)性高血壓的活性成分為槲皮素、芹菜素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素和大黃素等。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠降低自發(fā)性高血壓大鼠收縮壓，降低左室相對質(zhì)量，并能夠逆轉(zhuǎn)高血壓引起的心肌纖維破壞和線粒體損傷，其機制與激活過氧化物酶增殖體激活受體(PPAR-γ)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的表達，進而調(diào)節(jié)其下游肥厚基因心鈉肽(ANP)、腦鈉肽(BNP)mRNA的表達有關(guān)[24]。周秀等[25]的研究則認為，槲皮素改善高血壓誘導(dǎo)的心肌重構(gòu)機制與調(diào)節(jié)腸道菌群下調(diào)Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB途徑有關(guān)。木犀草素的降壓機制研究相對較早，主要與調(diào)節(jié)離子通道、抑制炎性因子表達和抑制醛糖還原酶活性有關(guān)[26]，目前研究主要集中于木犀草素的腎性高血壓心肌保護機制[27-28]。針對山奈酚的研究則證實了其良好的血管舒張作用，其機制可能與一氧化氮(NO)-環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)信號通路有關(guān)[29]。芹菜素和大黃素的降壓機制研究近年來得到了研究人員的廣泛關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)芹菜素能夠有效控制高脂高鹽誘導(dǎo)的大鼠血壓增高，改善高血壓引起的心臟肥大，其作用機制可能與降低大鼠血管緊張素Ⅱ水平、改善抗氧化酶活性有關(guān)[30-31]。同時，芹菜素抗氧化應(yīng)激作用能夠有效減輕高血壓誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化及膠原沉積，發(fā)揮靶器官保護效應(yīng)[32]，與大黃素的腎臟保護機制具有一致性[33-35]。本研究分子對接結(jié)果同樣證實，槲皮素、木犀草素、山奈酚、大黃素等活性成分與主要靶點能夠以疏水鍵的相互作用、氫鍵、π堆積作用發(fā)生對接結(jié)合，且結(jié)合強度較高。由此可見，清眩降壓湯的降壓作用可能是通過槲皮素、木犀草素、山奈酚、芹菜素和大黃素實現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)，清眩降壓湯調(diào)控原發(fā)性高血壓的主要靶點是PTGS2、PTGS1、AR、MAPK1、MAPK3、RELA等，主要為炎癥應(yīng)答、細胞增殖與凋亡、細胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)靶點，與近年來原發(fā)性高血壓慢性炎癥過程的認識具有一致性[36]。清眩降壓湯參與的生物過程主要包括血管發(fā)育、對細胞外刺激的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)等，分子功能主要包括氧化還原酶活性、脂質(zhì)結(jié)合、輔因子結(jié)合等，均與炎癥應(yīng)答、氧化應(yīng)激及代謝調(diào)節(jié)有關(guān)。涉及的生物學(xué)通路主要作用有MAPK、IL-17、PI3K-Akt、TNF等。近年來的研究表明，MAPK、TNF等炎性信號通路廣泛參與了高血壓心臟重構(gòu)與血壓調(diào)節(jié)過程[37]，并與PI3K-Akt等細胞周期信號通路協(xié)同作用，調(diào)節(jié)高血壓大鼠血管內(nèi)皮氧化應(yīng)激損傷、平滑肌表型轉(zhuǎn)化和膠原重構(gòu)的過程[38-40]。故推測清眩降壓湯主要通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路、TNF信號通路等炎癥通路及PI3K-Akt等細胞周期信號通路實現(xiàn)降壓作用。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析清眩降壓湯調(diào)節(jié)原發(fā)性高血壓的機制。結(jié)果表明清眩降壓湯的同一化合物可調(diào)控不同靶點，而同一靶點可干預(yù)不同的生物學(xué)過程及信號通路，體現(xiàn)了清眩降壓湯多通路、多靶點聯(lián)合作用調(diào)節(jié)血壓的特點，為清眩降壓湯治療原發(fā)性高血壓提供了科學(xué)依據(jù)和發(fā)掘清眩降壓湯潛在作用機制的基礎(chǔ)。但是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為大數(shù)據(jù)背景下的新興研究方法，主要通過數(shù)據(jù)挖掘方法進行活性成分和靶點關(guān)聯(lián)的預(yù)測，可能與實驗研究有一定出入，通過分子對接方法驗證其預(yù)測結(jié)果具有重要意義。本課題組在借助數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測清眩降壓湯治療原發(fā)性高血壓可能存在的靶點、通路等的基礎(chǔ)上，進一步對篩選出的相關(guān)基因及蛋白進行驗證，從細胞及分子層面明確清眩降壓湯通過炎癥通路、細胞周期信號調(diào)控原發(fā)性高血壓的作用機制，為清眩降壓湯治療原發(fā)性高血壓的中藥組方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。