魏佩玲，胡 波，張蓉銀，陸向梅，宮 平

（新疆畜牧科學(xué)院畜牧業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，新疆烏魯木齊 830000）

結(jié)核病菌除感染人外，還感染牛羊等哺乳動(dòng)物。人結(jié)核有10%以上是由牛、羊結(jié)核分枝桿菌引起的，牛羊在新疆的結(jié)核發(fā)病率超過(guò)2%，且長(zhǎng)期未受到關(guān)注（郭志文和武帥，2021；郭保民和劉紅葵，2012；楊醉宇等，2009；努爾扎提，2006）。為保障食品安全，避免牛、羊肉體內(nèi)藥物殘留，需加強(qiáng)對(duì)牛、羊肉食品的安全監(jiān)控，建立相應(yīng)的殘留檢測(cè)方法（李國(guó)華，2017；陳古麗，2014）。因此，本項(xiàng)目針對(duì)這一情況，建立牛、羊肉中抗結(jié)核類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。

目前，針對(duì)牛羊肉的前處理方法主要有快速溶劑萃取、固相萃取、液-液萃取、基質(zhì)固相分散技術(shù)等（吳會(huì)仙，2021；張曉燕，2021；喬麗娟，2020）。本實(shí)驗(yàn)室選用固相萃取方法，此技術(shù)具有高效性和準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)（雷攀明，2021）。近年來(lái)，由于QuEChERS具有操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)中（呂佳樂(lè)等，2020）。因此，本項(xiàng)目在建立檢測(cè)方法的過(guò)程中，在前處理部分（凈化條件的選擇）采用兩種前處理方式，對(duì)比優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)本單位的檢測(cè)能力、檢測(cè)范圍、檢測(cè)速度的提升具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所用羊肉、牛肉樣品購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。本實(shí)驗(yàn)所用試劑除特別注明者外均為分析純。乙腈為色譜純、甲酸為優(yōu)級(jí)純。標(biāo)準(zhǔn)品：利福平、利福噴丁、利福布汀標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98%。

1.2 主要儀器設(shè)備 超高效液相色譜-質(zhì)譜 聯(lián) 用 儀（I CLASS/XEVO TQD）、電 子 天 平（0.0001g）、高速冷凍離心機(jī)、水浴氮吹儀、固相萃取儀、數(shù)控超聲清洗器、渦旋混合儀。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

2.1.1 樣品的制備 將牛肉、羊肉切塊，分別用絞肉機(jī)處理后分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 樣品處理 稱取5.0 g均質(zhì)后的樣品置于50.0 mL具塞離心管中，用15.0 mL 1.0%冰乙酸溶液振蕩混勻，再加入15.0 mL乙腈，振蕩10 min。

混勻后加入QuEChERS提取包，振蕩混勻后10000 r/min，0～ 4℃離心 5 min，取 9.0 mL 上清液加入QuEChERS凈化管中，振蕩混勻后10000 r/min，0～4℃離心5 min，取5.0 mL上清液置于40℃下氮吹至0.4 mL，再加入1.0 mL乙腈溶解，過(guò)0.22μm濾膜后上機(jī)測(cè)定。

2.2 液相色譜條件 色譜柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；柱溫：30℃ ；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10μL；梯度洗脫方式見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3 質(zhì)譜條件 檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；

電離模式：ESI+；

毛細(xì)管電壓：2.50 kV；

錐孔電壓：45 V；

源溫度：150℃；

脫溶劑氣溫度：500℃；

脫溶劑氣流量：650 L/Hr

其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 主要質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 液相條件的優(yōu)化

3.1.1 色譜柱的選擇 本研究采用Waters ACQUITY UPLC? C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）來(lái)進(jìn)行分離。3種抗結(jié)核藥物在C18柱上的分離情況根據(jù)色譜峰可以看出，3種化合物均可以出峰且能達(dá)到有效分離，利福布汀、利福平、利福噴汀保留時(shí)間分別為4.29、4.50、4.68 min。

3.1.2 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水相為水，利福噴汀、利福布汀難以出峰，且目標(biāo)物的響應(yīng)值都很低；當(dāng)選擇0.2%甲酸水溶液為水相，甲醇為有機(jī)相時(shí)，利福噴汀、利福布汀會(huì)出現(xiàn)峰形疊加的情況；0.2%甲酸水溶液為水相，乙腈為有機(jī)相時(shí)，4種化合物的分離效果較好，峰形尖銳，與甲醇相比，乙腈的黏度更小，傳質(zhì)阻抗小，更能溶解、洗脫目標(biāo)化合物。綜上所述，以0.2%甲酸水溶液為水相、乙腈為有機(jī)相構(gòu)成流動(dòng)相體系，采用梯度洗脫方式可以使3種化合物取得較好的分離度。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 配制濃度為200 ng/mL的3種抗結(jié)核藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蠕動(dòng)泵自動(dòng)將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液推入到ESI離子源中，首先進(jìn)行全掃描，分別找出3個(gè)化合物的分子離子峰[M+H]+，然后對(duì)母離子逐級(jí)施加碰撞能量，使目標(biāo)化合物破裂以獲得二級(jí)碎片離子，得到豐度較強(qiáng)的兩個(gè)子離子，分別作為定量和定性離子。繼續(xù)優(yōu)化每一個(gè)目標(biāo)物的MS/MS參數(shù)，最終得到優(yōu)化后的母離子、子離子、碰撞能量等參數(shù)，3種抗結(jié)核藥物母離子的質(zhì)量數(shù)分別為823.12、877.16、847.15。根據(jù)響應(yīng)值判斷定量和定性離子，在實(shí)際樣品檢測(cè)中將二級(jí)離子的碎片信息與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，可以較好地找出目標(biāo)化合物，避免假陽(yáng)性情況的發(fā)生。

3.3 提取條件的選擇 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種抗結(jié)核藥物的提取回收率在酸性條件下明顯高于堿性和中性條件下。因此，選取實(shí)驗(yàn)室常用的甲酸、乙酸，進(jìn)一步研究酸的種類及濃度對(duì)3種抗結(jié)核藥物回收率的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加甲酸后對(duì)回收率的提高略高于乙酸。結(jié)果表明，當(dāng)甲酸濃度為0.1%時(shí)，3種抗結(jié)核藥物的回收率為60.8%～119.6%；當(dāng)甲酸濃度為0.5%時(shí)，3種抗結(jié)核藥物的回收率為15.3%～82.2%。根據(jù)化合物的性質(zhì)，試驗(yàn)選用了不同提取溶劑對(duì)3種抗結(jié)核藥物進(jìn)行提取。試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，當(dāng)用乙酸乙酯和正己烷提取時(shí)，利福平的回收率不足50%；當(dāng)用乙腈提取時(shí)，3種化合物的提取回收率為60.8%～119.6%，當(dāng)用甲醇提取時(shí)，3種化合物的提取回收率為26.1%～81.5%。

表3 不同提取溶劑對(duì)3種抗結(jié)核藥物提取效果的影響 %

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果確定用0.1%甲酸，乙腈為本試驗(yàn)的提取液。

3.4 凈化條件的選擇

3.4.1 固相萃取小柱的選擇 根據(jù)化合物的性質(zhì)，試驗(yàn)比較了Oasis HLB、Oasis PRiME HLB固相萃取柱及QuEChERS法對(duì)利福平、利福噴汀和利福布汀的保留情況。3種固相萃取柱的比較結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1可見(jiàn)，經(jīng)HLB萃取柱處理后，3種化合物回收率較其他兩種萃取柱低，波動(dòng)范圍大，利福噴汀最為明顯；經(jīng)PRiME HLB萃取柱處理后，利福平回收率較其他兩種萃取柱波動(dòng)范圍大，穩(wěn)定性較差，利福噴汀回收率偏低；經(jīng)QuEChERS法處理后，3種化合物回收率相比較其他兩種萃取柱相對(duì)穩(wěn)定，凈化效果較好。最終，本試驗(yàn)的固相萃取柱確定為QuEChERS法。

圖1 3種固相萃取柱的比較

3.4.2 洗脫體積的優(yōu)化 為優(yōu)化洗脫溶液，試驗(yàn)分別比較了乙腈、甲酸-甲醇、乙酸-甲醇作為洗脫溶液時(shí)3種抗結(jié)核藥物的過(guò)柱回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在洗脫溶液中添加少量乙酸更有利于3種化合物的洗脫，進(jìn)一步對(duì)乙酸濃度進(jìn)行比較后，試驗(yàn)最終確定洗脫溶液為甲醇（含0.5%乙酸）。依次用0.1%甲酸水溶液、水和50%甲醇水溶液對(duì)PRiMEHLB和HLB柱進(jìn)行淋洗，研究甲醇（含0.5%乙酸）的體積對(duì)3種抗結(jié)核藥物的洗脫情況。試驗(yàn)結(jié)果可以看出，甲醇（含0.5%乙酸）的洗脫體積為3.0 mL時(shí)，3種抗結(jié)核藥物基本全部洗脫，為確保3種抗結(jié)核藥物能全部洗脫，試驗(yàn)最終確定洗脫體積為4.0 mL。

3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限 配制基質(zhì)匹配曲線在本章建立的儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，用峰面積（y）分別對(duì)3種抗結(jié)核藥物的質(zhì)量濃度（x）作回歸分析，如表4所示，利福平、利福噴汀和利福布汀分別在0.1～20.0μg/L范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；以3倍和10倍信噪比分別為3種抗結(jié)核藥物的檢出限和定量限，利福平、利福噴丁和利福布汀的檢出限和定量限分別為0.30、0.31、0.22μg/kg 和 1.02、1.03、0.73μg/kg。

表4 3種抗結(jié)核藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

3.5.2 準(zhǔn)確度和精密度 為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度與精密度，試驗(yàn)以空白牛肉、羊肉樣品為基質(zhì)，通過(guò)添加低、中、高3個(gè)不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)水平做6組平行，按1.3節(jié)進(jìn)行樣品前處理后上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同基質(zhì)中3 種抗結(jié)核藥物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3種目標(biāo)化合物利福平、利福噴丁、利福布汀在牛肉的平均回收率分別為62.8%～109.2%、61.1%～115.4%、66.3%～105.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）分別為4.0%～16.3%，4.3%%～14.3%，4.6%～10.0%，方法的精密度與準(zhǔn)確度滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

3種目標(biāo)化合物利福平、利福噴丁、利福布汀在羊肉的平均回收率分別介于62.1%～94.2%、61.6%～114.6%、61.2%～108.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n=6）分別為 9.2% ～ 15.8%，11.2% ～18.9%，3.0%～11.3%，方法的精密度與準(zhǔn)確度滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.6 實(shí)際樣品的測(cè)定 購(gòu)買新疆當(dāng)?shù)爻?、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的羊肉、牛肉等畜產(chǎn)品共40份，待測(cè)樣品和質(zhì)控樣品均按上述方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)際樣品中，3種抗結(jié)核藥物均未檢出，但質(zhì)控樣品中3種抗結(jié)核藥物的回收率良好，且保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間保持一致，說(shuō)明該方法可用于實(shí)際樣品中3種抗結(jié)核藥物的殘留檢測(cè)。

4 結(jié)論

本研究主要以牛肉、羊肉為研究對(duì)象，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法用于檢測(cè)3種抗結(jié)核藥物殘留。該方法具有操作容易、再現(xiàn)性好、靈敏度和選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。準(zhǔn)確度和精密度滿足國(guó)標(biāo)GB/T 27404-2008中對(duì)回收率和精密度的要求，說(shuō)明該方法可用于動(dòng)物組織中3種抗結(jié)核藥物的殘留檢測(cè)，可滿足相關(guān)食品部門和企業(yè)對(duì)牛羊肉中抗結(jié)核類藥物殘留的檢測(cè)，為嚴(yán)格質(zhì)量提供必要的技術(shù)支持。