魏佩玲，胡 波，張蓉銀，陸向梅，宮 平

（新疆畜牧科學院畜牧業(yè)質(zhì)量標準研究所，新疆烏魯木齊 830000）

結(jié)核病菌除感染人外，還感染牛羊等哺乳動物。人結(jié)核有10%以上是由牛、羊結(jié)核分枝桿菌引起的，牛羊在新疆的結(jié)核發(fā)病率超過2%，且長期未受到關(guān)注（郭志文和武帥，2021；郭保民和劉紅葵，2012；楊醉宇等，2009；努爾扎提，2006）。為保障食品安全，避免牛、羊肉體內(nèi)藥物殘留，需加強對牛、羊肉食品的安全監(jiān)控，建立相應的殘留檢測方法（李國華，2017；陳古麗，2014）。因此，本項目針對這一情況，建立牛、羊肉中抗結(jié)核類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

目前，針對牛羊肉的前處理方法主要有快速溶劑萃取、固相萃取、液-液萃取、基質(zhì)固相分散技術(shù)等（吳會仙，2021；張曉燕，2021；喬麗娟，2020）。本實驗室選用固相萃取方法，此技術(shù)具有高效性和準確性高等優(yōu)點（雷攀明，2021）。近年來，由于QuEChERS具有操作簡單、快速、準確度高的特點，被廣泛應用到農(nóng)獸藥殘留檢測中（呂佳樂等，2020）。因此，本項目在建立檢測方法的過程中，在前處理部分（凈化條件的選擇）采用兩種前處理方式，對比優(yōu)缺點，對本單位的檢測能力、檢測范圍、檢測速度的提升具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 試驗材料 試驗所用羊肉、牛肉樣品購于農(nóng)貿(mào)市場。本實驗所用試劑除特別注明者外均為分析純。乙腈為色譜純、甲酸為優(yōu)級純。標準品：利福平、利福噴丁、利福布汀標準品純度均大于98%。

1.2 主要儀器設備 超高效液相色譜-質(zhì)譜 聯(lián) 用 儀（I CLASS/XEVO TQD）、電 子 天 平（0.0001g）、高速冷凍離心機、水浴氮吹儀、固相萃取儀、數(shù)控超聲清洗器、渦旋混合儀。

2 試驗方法

2.1 樣品處理

2.1.1 樣品的制備 將牛肉、羊肉切塊，分別用絞肉機處理后分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 樣品處理 稱取5.0 g均質(zhì)后的樣品置于50.0 mL具塞離心管中，用15.0 mL 1.0%冰乙酸溶液振蕩混勻，再加入15.0 mL乙腈，振蕩10 min。

混勻后加入QuEChERS提取包，振蕩混勻后10000 r/min，0～ 4℃離心 5 min，取 9.0 mL 上清液加入QuEChERS凈化管中，振蕩混勻后10000 r/min，0～4℃離心5 min，取5.0 mL上清液置于40℃下氮吹至0.4 mL，再加入1.0 mL乙腈溶解，過0.22μm濾膜后上機測定。

2.2 液相色譜條件 色譜柱：C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；柱溫：30℃ ；流速：0.3 mL/min；進樣量：10μL；梯度洗脫方式見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3 質(zhì)譜條件 檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；

電離模式：ESI+；

毛細管電壓：2.50 kV；

錐孔電壓：45 V；

源溫度：150℃；

脫溶劑氣溫度：500℃；

脫溶劑氣流量：650 L/Hr

其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 主要質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 液相條件的優(yōu)化

3.1.1 色譜柱的選擇 本研究采用Waters ACQUITY UPLC? C18 柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）來進行分離。3種抗結(jié)核藥物在C18柱上的分離情況根據(jù)色譜峰可以看出，3種化合物均可以出峰且能達到有效分離，利福布汀、利福平、利福噴汀保留時間分別為4.29、4.50、4.68 min。

3.1.2 流動相的選擇 試驗發(fā)現(xiàn)，當水相為水，利福噴汀、利福布汀難以出峰，且目標物的響應值都很低；當選擇0.2%甲酸水溶液為水相，甲醇為有機相時，利福噴汀、利福布汀會出現(xiàn)峰形疊加的情況；0.2%甲酸水溶液為水相，乙腈為有機相時，4種化合物的分離效果較好，峰形尖銳，與甲醇相比，乙腈的黏度更小，傳質(zhì)阻抗小，更能溶解、洗脫目標化合物。綜上所述，以0.2%甲酸水溶液為水相、乙腈為有機相構(gòu)成流動相體系，采用梯度洗脫方式可以使3種化合物取得較好的分離度。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 配制濃度為200 ng/mL的3種抗結(jié)核藥物混合標準溶液，用蠕動泵自動將混合標準溶液推入到ESI離子源中，首先進行全掃描，分別找出3個化合物的分子離子峰[M+H]+，然后對母離子逐級施加碰撞能量，使目標化合物破裂以獲得二級碎片離子，得到豐度較強的兩個子離子，分別作為定量和定性離子。繼續(xù)優(yōu)化每一個目標物的MS/MS參數(shù)，最終得到優(yōu)化后的母離子、子離子、碰撞能量等參數(shù)，3種抗結(jié)核藥物母離子的質(zhì)量數(shù)分別為823.12、877.16、847.15。根據(jù)響應值判斷定量和定性離子，在實際樣品檢測中將二級離子的碎片信息與標準溶液進行比較，可以較好地找出目標化合物，避免假陽性情況的發(fā)生。

3.3 提取條件的選擇 試驗發(fā)現(xiàn)，3種抗結(jié)核藥物的提取回收率在酸性條件下明顯高于堿性和中性條件下。因此，選取實驗室常用的甲酸、乙酸，進一步研究酸的種類及濃度對3種抗結(jié)核藥物回收率的影響。試驗發(fā)現(xiàn)，添加甲酸后對回收率的提高略高于乙酸。結(jié)果表明，當甲酸濃度為0.1%時，3種抗結(jié)核藥物的回收率為60.8%～119.6%；當甲酸濃度為0.5%時，3種抗結(jié)核藥物的回收率為15.3%～82.2%。根據(jù)化合物的性質(zhì)，試驗選用了不同提取溶劑對3種抗結(jié)核藥物進行提取。試驗結(jié)果如表3所示，當用乙酸乙酯和正己烷提取時，利福平的回收率不足50%；當用乙腈提取時，3種化合物的提取回收率為60.8%～119.6%，當用甲醇提取時，3種化合物的提取回收率為26.1%～81.5%。

表3 不同提取溶劑對3種抗結(jié)核藥物提取效果的影響 %

根據(jù)上述試驗結(jié)果確定用0.1%甲酸，乙腈為本試驗的提取液。

3.4 凈化條件的選擇

3.4.1 固相萃取小柱的選擇 根據(jù)化合物的性質(zhì)，試驗比較了Oasis HLB、Oasis PRiME HLB固相萃取柱及QuEChERS法對利福平、利福噴汀和利福布汀的保留情況。3種固相萃取柱的比較結(jié)果見圖1，由圖1可見，經(jīng)HLB萃取柱處理后，3種化合物回收率較其他兩種萃取柱低，波動范圍大，利福噴汀最為明顯；經(jīng)PRiME HLB萃取柱處理后，利福平回收率較其他兩種萃取柱波動范圍大，穩(wěn)定性較差，利福噴汀回收率偏低；經(jīng)QuEChERS法處理后，3種化合物回收率相比較其他兩種萃取柱相對穩(wěn)定，凈化效果較好。最終，本試驗的固相萃取柱確定為QuEChERS法。

圖1 3種固相萃取柱的比較

3.4.2 洗脫體積的優(yōu)化 為優(yōu)化洗脫溶液，試驗分別比較了乙腈、甲酸-甲醇、乙酸-甲醇作為洗脫溶液時3種抗結(jié)核藥物的過柱回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在洗脫溶液中添加少量乙酸更有利于3種化合物的洗脫，進一步對乙酸濃度進行比較后，試驗最終確定洗脫溶液為甲醇（含0.5%乙酸）。依次用0.1%甲酸水溶液、水和50%甲醇水溶液對PRiMEHLB和HLB柱進行淋洗，研究甲醇（含0.5%乙酸）的體積對3種抗結(jié)核藥物的洗脫情況。試驗結(jié)果可以看出，甲醇（含0.5%乙酸）的洗脫體積為3.0 mL時，3種抗結(jié)核藥物基本全部洗脫，為確保3種抗結(jié)核藥物能全部洗脫，試驗最終確定洗脫體積為4.0 mL。

3.5 方法學驗證

3.5.1 標準曲線、檢出限和定量限 配制基質(zhì)匹配曲線在本章建立的儀器條件下進行測定，用峰面積（y）分別對3種抗結(jié)核藥物的質(zhì)量濃度（x）作回歸分析，如表4所示，利福平、利福噴汀和利福布汀分別在0.1～20.0μg/L范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；以3倍和10倍信噪比分別為3種抗結(jié)核藥物的檢出限和定量限，利福平、利福噴丁和利福布汀的檢出限和定量限分別為0.30、0.31、0.22μg/kg 和 1.02、1.03、0.73μg/kg。

表4 3種抗結(jié)核藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

3.5.2 準確度和精密度 為驗證方法的準確度與精密度，試驗以空白牛肉、羊肉樣品為基質(zhì)，通過添加低、中、高3個不同水平的混合標準溶液進行添加回收試驗，每個水平做6組平行，按1.3節(jié)進行樣品前處理后上機測定，結(jié)果見表5。

表5 不同基質(zhì)中3 種抗結(jié)核藥物的加標回收率和相對標準偏差

3種目標化合物利福平、利福噴丁、利福布汀在牛肉的平均回收率分別為62.8%～109.2%、61.1%～115.4%、66.3%～105.9%，相對標準偏差（RSD，n=6）分別為4.0%～16.3%，4.3%%～14.3%，4.6%～10.0%，方法的精密度與準確度滿足相關(guān)標準要求。

3種目標化合物利福平、利福噴丁、利福布汀在羊肉的平均回收率分別介于62.1%～94.2%、61.6%～114.6%、61.2%～108.5%，相對標準偏差（RSD，n=6）分別為 9.2% ～ 15.8%，11.2% ～18.9%，3.0%～11.3%，方法的精密度與準確度滿足相關(guān)標準要求。

3.6 實際樣品的測定 購買新疆當?shù)爻?、農(nóng)貿(mào)市場的羊肉、牛肉等畜產(chǎn)品共40份，待測樣品和質(zhì)控樣品均按上述方法同時進行檢測。在實際樣品中，3種抗結(jié)核藥物均未檢出，但質(zhì)控樣品中3種抗結(jié)核藥物的回收率良好，且保留時間與標準溶液的保留時間保持一致，說明該方法可用于實際樣品中3種抗結(jié)核藥物的殘留檢測。

4 結(jié)論

本研究主要以牛肉、羊肉為研究對象，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法用于檢測3種抗結(jié)核藥物殘留。該方法具有操作容易、再現(xiàn)性好、靈敏度和選擇性高等優(yōu)點。準確度和精密度滿足國標GB/T 27404-2008中對回收率和精密度的要求，說明該方法可用于動物組織中3種抗結(jié)核藥物的殘留檢測，可滿足相關(guān)食品部門和企業(yè)對牛羊肉中抗結(jié)核類藥物殘留的檢測，為嚴格質(zhì)量提供必要的技術(shù)支持。