魏佩玲,胡 波,張蓉銀,陸向梅,宮 平
(新疆畜牧科學院畜牧業(yè)質(zhì)量標準研究所,新疆烏魯木齊 830000)
結(jié)核病菌除感染人外,還感染牛羊等哺乳動物。人結(jié)核有10%以上是由牛、羊結(jié)核分枝桿菌引起的,牛羊在新疆的結(jié)核發(fā)病率超過2%,且長期未受到關(guān)注(郭志文和武帥,2021;郭保民和劉紅葵,2012;楊醉宇等,2009;努爾扎提,2006)。為保障食品安全,避免牛、羊肉體內(nèi)藥物殘留,需加強對牛、羊肉食品的安全監(jiān)控,建立相應的殘留檢測方法(李國華,2017;陳古麗,2014)。因此,本項目針對這一情況,建立牛、羊肉中抗結(jié)核類藥物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。
目前,針對牛羊肉的前處理方法主要有快速溶劑萃取、固相萃取、液-液萃取、基質(zhì)固相分散技術(shù)等(吳會仙,2021;張曉燕,2021;喬麗娟,2020)。本實驗室選用固相萃取方法,此技術(shù)具有高效性和準確性高等優(yōu)點(雷攀明,2021)。近年來,由于QuEChERS具有操作簡單、快速、準確度高的特點,被廣泛應用到農(nóng)獸藥殘留檢測中(呂佳樂等,2020)。因此,本項目在建立檢測方法的過程中,在前處理部分(凈化條件的選擇)采用兩種前處理方式,對比優(yōu)缺點,對本單位的檢測能力、檢測范圍、檢測速度的提升具有重要意義。
1.1 試驗材料 試驗所用羊肉、牛肉樣品購于農(nóng)貿(mào)市場。本實驗所用試劑除特別注明者外均為分析純。乙腈為色譜純、甲酸為優(yōu)級純。標準品:利福平、利福噴丁、利福布汀標準品純度均大于98%。
1.2 主要儀器設備 超高效液相色譜-質(zhì)譜 聯(lián) 用 儀(I CLASS/XEVO TQD)、電 子 天 平(0.0001g)、高速冷凍離心機、水浴氮吹儀、固相萃取儀、數(shù)控超聲清洗器、渦旋混合儀。
2.1 樣品處理
2.1.1 樣品的制備 將牛肉、羊肉切塊,分別用絞肉機處理后分裝后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2.1.2 樣品處理 稱取5.0 g均質(zhì)后的樣品置于50.0 mL具塞離心管中,用15.0 mL 1.0%冰乙酸溶液振蕩混勻,再加入15.0 mL乙腈,振蕩10 min。
混勻后加入QuEChERS提取包,振蕩混勻后10000 r/min,0~ 4℃離心 5 min,取 9.0 mL 上清液加入QuEChERS凈化管中,振蕩混勻后10000 r/min,0~4℃離心5 min,取5.0 mL上清液置于40℃下氮吹至0.4 mL,再加入1.0 mL乙腈溶解,過0.22μm濾膜后上機測定。
2.2 液相色譜條件 色譜柱:C18柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm);柱溫:30℃ ;流速:0.3 mL/min;進樣量:10μL;梯度洗脫方式見表1。
表1 梯度洗脫程序
2.3 質(zhì)譜條件 檢測方式:多反應監(jiān)測(MRM)模式;
電離模式:ESI+;
毛細管電壓:2.50 kV;
錐孔電壓:45 V;
源溫度:150℃;
脫溶劑氣溫度:500℃;
脫溶劑氣流量:650 L/Hr
其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。
表2 主要質(zhì)譜參數(shù)
3.1 液相條件的優(yōu)化
3.1.1 色譜柱的選擇 本研究采用Waters ACQUITY UPLC? C18 柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm)來進行分離。3種抗結(jié)核藥物在C18柱上的分離情況根據(jù)色譜峰可以看出,3種化合物均可以出峰且能達到有效分離,利福布汀、利福平、利福噴汀保留時間分別為4.29、4.50、4.68 min。
3.1.2 流動相的選擇 試驗發(fā)現(xiàn),當水相為水,利福噴汀、利福布汀難以出峰,且目標物的響應值都很低;當選擇0.2%甲酸水溶液為水相,甲醇為有機相時,利福噴汀、利福布汀會出現(xiàn)峰形疊加的情況;0.2%甲酸水溶液為水相,乙腈為有機相時,4種化合物的分離效果較好,峰形尖銳,與甲醇相比,乙腈的黏度更小,傳質(zhì)阻抗小,更能溶解、洗脫目標化合物。綜上所述,以0.2%甲酸水溶液為水相、乙腈為有機相構(gòu)成流動相體系,采用梯度洗脫方式可以使3種化合物取得較好的分離度。
3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 配制濃度為200 ng/mL的3種抗結(jié)核藥物混合標準溶液,用蠕動泵自動將混合標準溶液推入到ESI離子源中,首先進行全掃描,分別找出3個化合物的分子離子峰[M+H]+,然后對母離子逐級施加碰撞能量,使目標化合物破裂以獲得二級碎片離子,得到豐度較強的兩個子離子,分別作為定量和定性離子。繼續(xù)優(yōu)化每一個目標物的MS/MS參數(shù),最終得到優(yōu)化后的母離子、子離子、碰撞能量等參數(shù),3種抗結(jié)核藥物母離子的質(zhì)量數(shù)分別為823.12、877.16、847.15。根據(jù)響應值判斷定量和定性離子,在實際樣品檢測中將二級離子的碎片信息與標準溶液進行比較,可以較好地找出目標化合物,避免假陽性情況的發(fā)生。
3.3 提取條件的選擇 試驗發(fā)現(xiàn),3種抗結(jié)核藥物的提取回收率在酸性條件下明顯高于堿性和中性條件下。因此,選取實驗室常用的甲酸、乙酸,進一步研究酸的種類及濃度對3種抗結(jié)核藥物回收率的影響。試驗發(fā)現(xiàn),添加甲酸后對回收率的提高略高于乙酸。結(jié)果表明,當甲酸濃度為0.1%時,3種抗結(jié)核藥物的回收率為60.8%~119.6%;當甲酸濃度為0.5%時,3種抗結(jié)核藥物的回收率為15.3%~82.2%。根據(jù)化合物的性質(zhì),試驗選用了不同提取溶劑對3種抗結(jié)核藥物進行提取。試驗結(jié)果如表3所示,當用乙酸乙酯和正己烷提取時,利福平的回收率不足50%;當用乙腈提取時,3種化合物的提取回收率為60.8%~119.6%,當用甲醇提取時,3種化合物的提取回收率為26.1%~81.5%。
表3 不同提取溶劑對3種抗結(jié)核藥物提取效果的影響 %
根據(jù)上述試驗結(jié)果確定用0.1%甲酸,乙腈為本試驗的提取液。
3.4 凈化條件的選擇
3.4.1 固相萃取小柱的選擇 根據(jù)化合物的性質(zhì),試驗比較了Oasis HLB、Oasis PRiME HLB固相萃取柱及QuEChERS法對利福平、利福噴汀和利福布汀的保留情況。3種固相萃取柱的比較結(jié)果見圖1,由圖1可見,經(jīng)HLB萃取柱處理后,3種化合物回收率較其他兩種萃取柱低,波動范圍大,利福噴汀最為明顯;經(jīng)PRiME HLB萃取柱處理后,利福平回收率較其他兩種萃取柱波動范圍大,穩(wěn)定性較差,利福噴汀回收率偏低;經(jīng)QuEChERS法處理后,3種化合物回收率相比較其他兩種萃取柱相對穩(wěn)定,凈化效果較好。最終,本試驗的固相萃取柱確定為QuEChERS法。
圖1 3種固相萃取柱的比較
3.4.2 洗脫體積的優(yōu)化 為優(yōu)化洗脫溶液,試驗分別比較了乙腈、甲酸-甲醇、乙酸-甲醇作為洗脫溶液時3種抗結(jié)核藥物的過柱回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在洗脫溶液中添加少量乙酸更有利于3種化合物的洗脫,進一步對乙酸濃度進行比較后,試驗最終確定洗脫溶液為甲醇(含0.5%乙酸)。依次用0.1%甲酸水溶液、水和50%甲醇水溶液對PRiMEHLB和HLB柱進行淋洗,研究甲醇(含0.5%乙酸)的體積對3種抗結(jié)核藥物的洗脫情況。試驗結(jié)果可以看出,甲醇(含0.5%乙酸)的洗脫體積為3.0 mL時,3種抗結(jié)核藥物基本全部洗脫,為確保3種抗結(jié)核藥物能全部洗脫,試驗最終確定洗脫體積為4.0 mL。
3.5 方法學驗證
3.5.1 標準曲線、檢出限和定量限 配制基質(zhì)匹配曲線在本章建立的儀器條件下進行測定,用峰面積(y)分別對3種抗結(jié)核藥物的質(zhì)量濃度(x)作回歸分析,如表4所示,利福平、利福噴汀和利福布汀分別在0.1~20.0μg/L范圍內(nèi)呈良好線性,相關(guān)系數(shù)均大于0.99;以3倍和10倍信噪比分別為3種抗結(jié)核藥物的檢出限和定量限,利福平、利福噴丁和利福布汀的檢出限和定量限分別為0.30、0.31、0.22μg/kg 和 1.02、1.03、0.73μg/kg。
表4 3種抗結(jié)核藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
3.5.2 準確度和精密度 為驗證方法的準確度與精密度,試驗以空白牛肉、羊肉樣品為基質(zhì),通過添加低、中、高3個不同水平的混合標準溶液進行添加回收試驗,每個水平做6組平行,按1.3節(jié)進行樣品前處理后上機測定,結(jié)果見表5。
表5 不同基質(zhì)中3 種抗結(jié)核藥物的加標回收率和相對標準偏差
3種目標化合物利福平、利福噴丁、利福布汀在牛肉的平均回收率分別為62.8%~109.2%、61.1%~115.4%、66.3%~105.9%,相對標準偏差(RSD,n=6)分別為4.0%~16.3%,4.3%%~14.3%,4.6%~10.0%,方法的精密度與準確度滿足相關(guān)標準要求。
3種目標化合物利福平、利福噴丁、利福布汀在羊肉的平均回收率分別介于62.1%~94.2%、61.6%~114.6%、61.2%~108.5%,相對標準偏差(RSD,n=6)分別為 9.2% ~ 15.8%,11.2% ~18.9%,3.0%~11.3%,方法的精密度與準確度滿足相關(guān)標準要求。
3.6 實際樣品的測定 購買新疆當?shù)爻?、農(nóng)貿(mào)市場的羊肉、牛肉等畜產(chǎn)品共40份,待測樣品和質(zhì)控樣品均按上述方法同時進行檢測。在實際樣品中,3種抗結(jié)核藥物均未檢出,但質(zhì)控樣品中3種抗結(jié)核藥物的回收率良好,且保留時間與標準溶液的保留時間保持一致,說明該方法可用于實際樣品中3種抗結(jié)核藥物的殘留檢測。
本研究主要以牛肉、羊肉為研究對象,建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法用于檢測3種抗結(jié)核藥物殘留。該方法具有操作容易、再現(xiàn)性好、靈敏度和選擇性高等優(yōu)點。準確度和精密度滿足國標GB/T 27404-2008中對回收率和精密度的要求,說明該方法可用于動物組織中3種抗結(jié)核藥物的殘留檢測,可滿足相關(guān)食品部門和企業(yè)對牛羊肉中抗結(jié)核類藥物殘留的檢測,為嚴格質(zhì)量提供必要的技術(shù)支持。