李 濤，王召朋，楊明彩，李明勇，劉 曼，屈平平*

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061；2.青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司，山東青島 266400）

合生素是由益生菌與益生元相互配伍而成的一種微生態(tài)制劑，可發(fā)揮1+1＞2的效果，是當(dāng)前飼料生產(chǎn)中使用較多的一種抗生素替代品。本項目組研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加由枯草芽孢桿菌制劑、凝結(jié)芽孢桿菌制劑和低聚木糖配伍而成的合生素，可提高新西蘭斷奶肉兔的生產(chǎn)性能、免疫水平，改善腸壁形態(tài)，提高消化酶活性（李濤等，2022），具有較好的應(yīng)用前景。本試驗利用高通量測序技術(shù)，從基因水平分析合生素代替抗生素對新西蘭斷奶肉兔盲腸微生物物種豐度及多樣性的影響，為合生素在肉兔生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 枯草芽孢桿菌制劑：活菌數(shù)為109cfu/g，由上海某公司提供；凝結(jié)芽孢桿菌制劑：活菌數(shù)為1010cfu/g，由青島某公司提供；低聚木糖：純度為95%，購自山東龍力生物科技有限公司。

1.2 試驗設(shè)計及試驗日糧 試驗在山東某肉兔養(yǎng)殖場進行，選用300只35日齡斷奶新西蘭肉兔，隨機分為3組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)20只肉兔（公、母各半）。合生素組（標(biāo)記為H）飼喂添加有0.04%合生素的基礎(chǔ)日糧；抗生素組（標(biāo)記為K）飼喂添加有土霉素的基礎(chǔ)日糧；對照組（標(biāo)記為D）僅飼喂基礎(chǔ)日糧。每天08：00和17：00投喂2次飼料，投料量以兔子充分吃飽而幾乎不留料為準(zhǔn)，預(yù)飼期3 d，正試期42 d。肉兔免疫程序及其他飼養(yǎng)管理按兔場常規(guī)進行。

1.3 盲腸微生物高通量測序、優(yōu)勢物種及組間差異性分析 在正試期第42天，每組隨機選取10只試驗兔進行屠宰，迅速取出盲腸內(nèi)容物，放入5 mL滅菌無酶帶蓋離心管中，放進液氮罐中速凍20 min，然后取出放入-80℃冰箱中冷凍保存。樣品委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司提取樣本腸道微生物基因組DNA。根據(jù)所擴增的16S區(qū)域特點，構(gòu)建小片段文庫，基于Illumina Nova測序平臺對該文庫進行雙末端測序，經(jīng)過Reads拼接、過濾后得到有效數(shù)據(jù)，基于97%一致性將序列聚類成為運算分類單元（OTUs），然后對運算分類單元序列比對到Silva132數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析。為了尋找在門（Phylum）、綱（Class）、科（Family）、屬（Genus）4種水平下組間的差異物種，對各組物種相對豐度做組間T-test檢驗，找出差異顯著（P＜0.05）的物種。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平

1.4 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行初步處理，利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件的ANOVA程序進行方差分析，試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P＜0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 門水平上組間差異物種 由圖1可知，合生素組與抗生素組和對照組的差異物種均為脫硫桿菌門（Desulfobacterota）和放線菌門（Actinobacteriota），且合生素組脫硫桿菌門（Desulfobacterota）和放線菌門（Actinobacteriota）的相對豐度均顯著高于抗生素組和對照組（P＜ 0.05）。

圖1 門水平下合生素組與抗生素組、合生素組與對照組組間差異物種

2.2 綱水平上組間差異物種 由圖2可知，合生素組與抗生素組和對照組的差異物種均為脫硫弧菌綱（Desulfovibrionia）、梭菌綱（Clostridia）和紅蝽菌綱（Coriobacteriia），且合生素組脫硫弧菌綱（Desulfovibrionia）、梭菌綱（Clostridia）和 紅 蝽菌綱（Coriobacteriia）的相對豐度均顯著高于抗生素組和對照組（P＜0.05）。

圖2 綱水平下合生素組與抗生素組、合生素組與對照組組間差異物種

2.3 科水平上組間差異物種 由圖3可知，合生素組與抗生素組組間差異物種為脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、真桿菌科（Eubacteriaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、Atopobiaceae、伊格爾茲氏菌科（Eggerthellaceae）；合生素組與對照組組間差異物種為毛螺菌科（Lachnospiraceae）、脫 硫 弧 菌 科（Desulfovibrionaceae）、真 桿 菌 科（Eubacteriaceae）、Atopobiaceae和伊格爾茲氏菌科（Eggerthellaceae），且以上差異物種在合生素組的相對豐度最高。

圖3 科水平下合生素組與抗生素組、合生素組與對照組組間差異物種

2.4 屬水平上組間差異物種 由圖4可知，合生素組與抗生素組組間差異物種為脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）；且合生素組與對照組組間差異物種為另支菌屬（Alistipes）、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospiraceae_NK4A136_group）和脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）；且以上差異物種在合生素組的相對豐度最高。

圖4 屬水平下合生素組與抗生素組、合生素組與對照組組間差異物種

3 討論

盲腸微生物群落與宿主保持著相對平衡的穩(wěn)定狀態(tài)，以充分發(fā)揮生物屏障作用、免疫作用、代謝作用、營養(yǎng)作用等，是維持動物機體健康，提高生產(chǎn)性能的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，合生素組試驗兔盲腸菌群中某些物種（如放線菌門、毛螺菌科、另支菌屬、脫硫弧菌等）的相對豐度顯著升高。研究表明，放線菌門（Actinobacteriota）可產(chǎn)生多種抗菌素，如鏈霉素、土霉素、四環(huán)素、慶大霉素，還能產(chǎn)生各種蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、維生素B12和有機酸等（陳明等，2020）。毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）包含毛螺菌屬、丁酸弧菌屬、羅氏菌屬等細菌，該菌科具有降解毒素、抵制致病菌感染的作用，毛螺菌是典型的短鏈脂肪酸（SCFAs）產(chǎn)生菌，與粗飼料中果膠降解密切相關(guān)，能促進瘤胃微生物蛋白質(zhì)合成，進而提高動物生產(chǎn)性能（陳丹等，2020）。另支菌屬（Alistipes）屬于擬桿菌門中的一種相對新的細菌屬，革蘭氏陰性專性厭氧，是腸道共生菌，可生產(chǎn)多種短鏈脂肪酸（丙酸和乙酸鹽），具有抗炎機制，還可能對肝纖維化、癌癥免疫治療和心血管疾病等有保護作用，與鏈球菌存在拮抗作用（PARKER B等，2020）。脫硫弧菌（Desulfovibrio）為厭氧菌，屬于耗氫微生物，也是腸道內(nèi)一種重要的益生菌（李佳駿，2018）。因此，以上物種相對豐度升高，擴大了盲腸有益菌體系，使盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)更合理化。

4 結(jié)論

本項目組配伍的合生素代替抗生素添加于兔料，未對新西蘭斷奶肉兔盲腸優(yōu)勢物種產(chǎn)生顯著影響，且在一定程度上提高了某些有益菌的相對豐度，維持了良好的腸道微生態(tài)平衡，在兔料生產(chǎn)中具有一定的替抗?jié)摿Α?/p>