蘇俊宇，陳 辰，李 偉，雷 駱，祝駿賢，羅來(lái)福，耿露露，史 偉，李健松，張繼平，朱新平

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510380；3.惠州市財(cái)興實(shí)業(yè)有限公司，廣東 惠州 561700）

中華鱉（Pelodiscus sinensis）又稱(chēng)甲魚(yú)，是我國(guó)重要的名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖物種[1]。近年來(lái)，中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖發(fā)展迅速，以“保溫車(chē)間＋養(yǎng)殖池＋地下水”為主。充氣增氧是中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖過(guò)程中維持水質(zhì)穩(wěn)定，保持水體微生態(tài)平衡的重要措施。微孔增氧技術(shù)是新興的高效水體增氧技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)管道將增壓空氣輸送到養(yǎng)殖池底，氣體通過(guò)管壁的微孔以微氣泡形態(tài)逸散于水中，有氣泡上升速率慢、滯留時(shí)間長(zhǎng)、氣水接觸面積大、傳質(zhì)效率高的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)水體高效、持久復(fù)氧，提高水體中好氧微生物生理活性，加快污染物降解，促進(jìn)水體凈化[2-3]。該技術(shù)目前已用于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)水體增氧[4-5]等多個(gè)漁業(yè)領(lǐng)域，并取得良好效果。

本研究比較微孔管和普通通底管兩種充氣模式下中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體的常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)，用高通量測(cè)序方法對(duì)水體微生物進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析，探討不同充氣模式下水體微生物的群落結(jié)構(gòu)組成和環(huán)境因素，為中華鱉工廠(chǎng)化健康養(yǎng)殖研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實(shí)驗(yàn)在惠州市財(cái)興實(shí)業(yè)有限公司中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖車(chē)間進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)置微孔管和通底管兩種充氣模式（分別記為MA、DG 組），兩種充氣管均購(gòu)自無(wú)錫江諾增氧設(shè)備有限公司。微孔管為三元乙丙橡膠（EPDM）材質(zhì)，孔徑為25 μm；通底管為聚氯乙烯（PVC）材質(zhì)，孔徑為4 mm。兩種充氣模式充氣管道在池底的布設(shè)如圖1所示。

圖1 養(yǎng)殖池充氣裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of the inflation device installed in the indoor aquaculture ponds

每種充氣模式均設(shè)5 個(gè)重復(fù)養(yǎng)殖池，每個(gè)養(yǎng)殖池容積225 m3。實(shí)驗(yàn)期間，每池投放規(guī)格為（300±40）g 的中華鱉15 000 只，投喂相同組分的配方飼料，并由專(zhuān)人統(tǒng)一管理，車(chē)間內(nèi)水溫保持在（30±0.5）℃。每日在投料后1 h（5:00、12:00、18:00）充氣1 h。兩種充氣模式用功率為15 kW 的同一羅茨鼓風(fēng)機(jī)進(jìn)氣。

飼養(yǎng)2 個(gè)月后，水色變?yōu)楹稚⒊霈F(xiàn)絮狀沉淀物，分別從每個(gè)養(yǎng)殖池中采集1 L 水樣，用于后續(xù)分析。水樣采集前1 h 停止充氣，用五點(diǎn)采樣法采樣。使用便攜式水質(zhì)分析儀（奧克丹，OCT-V型）測(cè)定pH值、溶氧量（DO）、亞硝態(tài)氮（NO2--N）、活性磷酸鹽（PO43-）和氨氮（TAN）5 個(gè)水質(zhì)指標(biāo)。用孔徑0.22 μm 的醋酸纖維素濾膜（Merk Millipore，USA）對(duì)樣本進(jìn)行真空抽濾，取出濾膜，裝入滅菌離心管，置于液氮保存待測(cè)。

1.2 DNA提取和Illumina高通量測(cè)序

將濾膜用超低溫研磨儀研磨，按照DNA提取試劑盒（HiPure Soil DNA Kits，廣州美基生物科技有限公司）提取微生物總DNA。用NanoDrop 2000 檢測(cè)DNA 濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

用帶有barcode 的特異引物341F（5′-CCTAC‐GGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACH‐VGGGTWTCTAAT-3′）對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增分為兩輪，第一輪擴(kuò)增體系為：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1.5 μL，KOD 酶（東洋紡(上海)生物科技有限公司）1 μL，DNA模板30 ng，補(bǔ)足ddH2O至50 μL。第1 輪擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃2 min；98 ℃10 s，55℃30 s，68 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；68 ℃5 min。第1輪PCR 產(chǎn)物用AMPure XP Beads 純化，用Qubit 3.0定量。第2 輪擴(kuò)增體系為：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，Index Primer（10 μmol/L）1 μL，Universal PCR Primer（10 μmol/L）1 μL，KOD 酶1 μL，DNA 模板30 ng，補(bǔ)足ddH2O 至50 μL。第2 輪擴(kuò)增程序：94 ℃2 min；98 ℃10 s，65 ℃30 s，68 ℃30 s，12 個(gè)循環(huán)；68 ℃5 min。使用AMPure XP Beads 純化第2 輪擴(kuò)增產(chǎn)物。純化產(chǎn)物使用ABI StepOnePlus RealTime PCR System（Life Technologies，美國(guó)）進(jìn)行定量。使用Illumina公司的Novaseq 6000測(cè)序儀，按照PE250模式進(jìn)行混池測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

高通量測(cè)序數(shù)據(jù)按照Illumina 標(biāo)準(zhǔn)流程對(duì)原始數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行質(zhì)控(QC)，獲得去除低質(zhì)量讀數(shù)（reads）的有效數(shù)據(jù)（clean data）。將過(guò)濾后reads拼接為標(biāo)簽（tags），對(duì)低質(zhì)量tags 進(jìn)行過(guò)濾，獲得用于后續(xù)分析的凈標(biāo)簽（clean tags）。

為劃分操作分類(lèi)單元（OTU），用USEARCH 軟件的UPARSE 算法，在相似性97% 的水平下對(duì)clean tags進(jìn)行聚類(lèi)分析，用UCHIME算法去除聚類(lèi)比對(duì)中檢測(cè)到的嵌合體，用R程序包venndiagram對(duì)聚類(lèi)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

基于聚類(lèi)分析結(jié)果，用RDP classifier 軟件的Naive Bayesian assignment 算法對(duì)每個(gè)OUT 的代表序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)⒃陂T(mén)、科和屬水平上分析兩種充氣模式養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)。以柱形累加圖（門(mén)、科水平）或條形圖（屬水平）呈現(xiàn)相對(duì)豐度（樣本的物種tags 數(shù)/樣本總tags 數(shù)）達(dá)到1%以上的物種注釋結(jié)果，并采用Welch'st檢驗(yàn)比較物種間的相對(duì)豐度。

為評(píng)價(jià)兩種充氣模式下養(yǎng)殖水體微生物的多樣性水平，用QIIME軟件分別計(jì)算兩種充氣模式的微生物群落的α-物種多樣性指數(shù)，包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)和覆蓋率（%），并用t檢驗(yàn)比較多樣性指數(shù)的組間差異。為比較兩種充氣模式群落結(jié)構(gòu)的差異，基于樣本間的Jaccard 距離，使用R 程序包vegan 計(jì)算組間的β-多樣性，并進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）。用R 程序包ggplot2 繪制PCoA主坐標(biāo)分析圖。

用SPSS 22.0 軟件對(duì)水體理化指標(biāo)的組間差異進(jìn)行t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U 檢驗(yàn)；為評(píng)價(jià)水質(zhì)因子和微生物群落相對(duì)豐度的關(guān)系，使用R 程序包vegan對(duì)屬水平相對(duì)豐度排名前10的微生物群落與前述5個(gè)水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行冗余分析（RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種充氣模式中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體的主要水質(zhì)指標(biāo)

在兩種充氣模式中華鱉養(yǎng)殖水體的主要水質(zhì)指標(biāo)如表1 所示。兩組水樣的pH 均呈弱酸性，DG組的pH 值（5.16 ± 0.32）顯著低于MA 組（6.22 ±0.24）；MA 組溶解氧含量較高（10.86 ± 1.98），顯著高于DG 組（4.44 ± 0.47）；兩組水樣的亞硝態(tài)氮含量均處于較低水平，MA 組含量（0.18 ± 0.08）顯著低于DG 組（0.53 ± 0.08）；兩組的磷酸鹽和氨氮含量均處于較高水平，但兩組間無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

表1 兩種充氣模式下中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體的主要水質(zhì)指標(biāo)Table 1 Five water quality indices of the indoor industrial aquaculture system for Pelodiscus sinensis under two different aeration methods mg/L

2.2 兩種充氣模式下中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體微生物的OUTs分布

高通量測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)濾后，共獲得1293 143 條高質(zhì)量reads。去除嵌合體以后，最終獲得1168 010條有效tags，平均每個(gè)樣本的高質(zhì)量tags數(shù)為116 801條。OTU 聚類(lèi)分析結(jié)果（圖2）表明，DG 組的平均OUTs 數(shù)目為463，MA 組的平均OTUs 數(shù)目為591。兩組共有的OTUs 數(shù)目為308，DG 組獨(dú)有的OTUs 數(shù)目為155，MA 組獨(dú)有的OTU 數(shù)目為283。

圖2 兩種充氣模式下養(yǎng)殖水體微生物OTUs分布維恩圖Fig.2 Venn diagram showing the OTU numbers in water of aquaculture system by two aeration methods

2.3 兩種充氣模式下中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體微生物多樣性

2.3.1 α-物種多樣性指數(shù) 如表2 所示，MA 組水體微生物的4 種多樣性指數(shù)（Ace 指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)）均顯著高于DG 組（P ＜0.05），表明采用微孔管充氣的中華鱉養(yǎng)殖水體微生物多樣性明顯優(yōu)于通底管充氣模式。

表2 兩種充氣模式下中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體微生物α-物種多樣性指數(shù)Table 2 Alpha species diversity index of microbial taxa in the indoor industrial aquaculture system for Pelodiscus sinensis under two different aeration methods

2.3.2 β-多樣性分析 圖3 顯示，兩種充氣模式下養(yǎng)殖水體的微生物分別呈現(xiàn)明顯聚類(lèi)，DG 組樣本只分布于第1、3 象限，MA 組樣本主要分布在第4 象限，主坐標(biāo)PCo1 和PCo2 的方差貢獻(xiàn)率分別為85.00%和5.25%。表明兩種充氣模式的中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，微生物群落分區(qū)明顯。

圖3 基于Jaccard距離的主坐標(biāo)分析Fig.3 Principal coordinate analysis based on Jaccard distances

2.4 兩種充氣模式下中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體微生物群落結(jié)構(gòu)組成

2.4.1 門(mén)水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成 兩種充氣模式下的中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體共檢測(cè)到22 個(gè)門(mén)類(lèi)微生物，組間的微生物門(mén)類(lèi)組成相似。其中，變形菌門(mén)（Proteobacteria）等19 個(gè)門(mén)為兩種充氣模式共有。藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）為DG 組特有；納古菌門(mén)（Nanoarchaeaeota）和Hydrogenedentes 為MA 組 特有。特有門(mén)類(lèi)的相對(duì)豐富在群落組成中均小于1%。

按平均相對(duì)豐度大于10%進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌門(mén)統(tǒng)計(jì)，兩種充氣模式的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)差異顯著（圖4）。DG 組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)較為集中，66.99%為變形菌門(mén)，12.81%為髕骨細(xì)菌門(mén)（Patescibacteria）；MA 組的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（44.81%）、髕骨細(xì)菌門(mén)（13.15%）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes，10.49%）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes，9.56%）。

2.4.2 科水平微生物群落結(jié)構(gòu)組成 在科水平，兩種充氣模式下中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體的微生物優(yōu)勢(shì)菌科（以平均相對(duì)豐度＞10%統(tǒng)計(jì)）差異顯著（圖4）。DG 組的優(yōu)勢(shì)菌科為紅桿菌科（Rhodobacteraceae，41.25%）和紅環(huán)菌科（Rhodocyclaccae，17.32%），MA組的優(yōu)勢(shì)菌科為紅環(huán)菌科（34.07%）和芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae，10.48%）。

圖4 兩種充氣模式下養(yǎng)殖水體微生物門(mén)與科水平的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of microbial taxa in water of aquaculture system by two aeration methods at phylum and family levels

2.4.3 屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成 在屬水平，兩種充氣模式下中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體的微生物組成相似（圖5），但不同微生物類(lèi)群間相對(duì)豐度差異較大。兩種充氣模式均有較高比例未被注釋的菌屬（DG 組為68.70%，MA 組為79.48%）。在已鑒定的菌屬中，Denitratisoma屬是兩種充氣模式下的共有優(yōu)勢(shì)菌屬，組間相對(duì)豐度差異顯著（DG 組為14.38%，MA 組為4.63%）。除Denitratisoma屬外，Luteolibacter屬（4.01%）、Limnobacter屬（2.06%）、新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium，1.34%）、埃希氏-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella，1.37%）、Lacunisphaera屬（1.32%）和小紡錘狀菌屬（Fusibacter，1.31%）為DG 組的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度均顯著高于MA 組；Sulfuritalea屬（3.91%）、Azospira屬（1.29%）和Tetrasphaera屬（1.17%）為MA 組的優(yōu)勢(shì)菌屬,相對(duì)豐度均顯著高于DG組。

圖5 兩種充氣模式下中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體微生物屬水平相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of microbial taxa in water of aquaculture system by two aeration methods at the genus level

2.5 兩種充氣模式下微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性

圖6 可見(jiàn)，RDA1 和RDA2 兩個(gè)排序軸對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的解釋程度分別為93.66%和5.66%。水體微生物群落結(jié)構(gòu)與pH 和DO 有正相關(guān)性趨勢(shì)（r2=0.907，P=0.081 和r2=0.934，P=0.061），與亞硝態(tài)氮有負(fù)相關(guān)性趨勢(shì)（r2=0.922，P=0.100）。其 中，Denitratisoma屬、Novosphingobium屬、Lacunisphaera屬、Fusibacter屬 和Limnobacter屬與pH 和DO 呈顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，而Limnobacter屬、Escherichia-Shigella屬和Azospira屬均與pH、DO 有顯著或極顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖7）。

圖6 屬水平微生物群落結(jié)構(gòu)組成與環(huán)境因子的RDA分析Fig.6 Redundancy analysis(RDA)of the top 10 genus microbial taxa and five environmental factors

圖7 屬水平物種相對(duì)豐度與環(huán)境因子相關(guān)性熱圖Fig.7 Heat map of the correlation between relative abundance of top 10 genus microbial taxa and five environmental factors

3 討論

養(yǎng)殖水體環(huán)境的穩(wěn)定對(duì)于促進(jìn)水體物質(zhì)代謝，控制水產(chǎn)養(yǎng)殖病害和水質(zhì)調(diào)控有重要作用。自然條件下池塘養(yǎng)殖水體溶氧主要來(lái)源于浮游植物的光合作用。由于中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖在遮光恒溫室內(nèi)進(jìn)行，浮游植物光合作用受到完全抑制。因此，高效的充氣增氧，以建立水體良性微生態(tài)環(huán)境更為重要。微孔管充氣方式因其充氣氣泡在水體中上升速率慢、浮力小，在水體中滯留時(shí)間長(zhǎng)，氧傳質(zhì)效率高，可使水體溶氧量顯著增加[6]。本研究顯示，使用微孔管充氣的水體溶解氧含量顯著高于通底管充氣（P＜0.05），亞硝態(tài)氮含量顯著低于后者（P＜0.05），水體酸堿度更接近中性，水質(zhì)環(huán)境更有利于水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生存健康。這與魏亞南等[7]使用微孔曝氣方式調(diào)控海參（Stichopus japonicus）池塘水質(zhì)環(huán)境的結(jié)果一致。研究表明，在養(yǎng)殖過(guò)程中使用微孔增氧技術(shù)，可有效提高養(yǎng)殖魚(yú)塘的產(chǎn)量和水產(chǎn)品的品質(zhì)，降低養(yǎng)殖尾水的污染。羅楠等[8]比較了草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）養(yǎng)殖池塘微孔增氧與葉輪式增氧機(jī)增氧效果。結(jié)果表明，試驗(yàn)塘（微孔增氧）的草魚(yú)終末體質(zhì)量、增重率、特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照塘（葉輪式增氧），飼料系數(shù)顯著低于對(duì)照塘。在本研究的后續(xù)工作中，我們也發(fā)現(xiàn)使用微孔管充氣的養(yǎng)殖池商品鱉產(chǎn)量達(dá)33～40 kg/m2，比使用普通底管模式可提高15%以上。

本研究顯示，MA 組微生物的OTUs 數(shù)目和4 個(gè)α-多樣性指數(shù)均顯著高于DG組，表明MA組的微生物多樣性水平明顯優(yōu)于DG組。RDA分析進(jìn)一步顯示，微生物群落結(jié)構(gòu)與溶解氧、pH 密切相關(guān)。魚(yú)類(lèi)池塘水環(huán)境的穩(wěn)定性與微生物多樣性關(guān)系密切，當(dāng)水體微生物群落多樣性增加時(shí)，可降低水產(chǎn)養(yǎng)殖病害暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[11]。因此，本研究的微孔管充氣可有效促進(jìn)中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定，對(duì)于降低及控制養(yǎng)殖過(guò)程中病害暴發(fā)有潛在的積極意義。

本研究顯示，不同的充氣模式對(duì)于養(yǎng)殖水體的微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。在門(mén)水平上兩種充氣模式的第一優(yōu)勢(shì)菌均為變形菌門(mén)，DG 組的相對(duì)豐度顯著高于MA 組（MA 組44.81%，DG 組66.99%）。變形菌門(mén)菌類(lèi)是淡水養(yǎng)殖水體中分布最為廣泛的微生物[11]，在生物腸道內(nèi)是極為常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌[12]，在土壤和污水處理的氮、磷轉(zhuǎn)換方面中有極重要作用[13-14]。本研究中，兩種充氣模式下養(yǎng)殖水體微生物均主要由變形菌門(mén)紅桿菌科和紅環(huán)菌科構(gòu)成，但二者平均相對(duì)豐度差異極顯著（P＜0.01）。紅桿菌科和紅環(huán)菌科分屬變形菌門(mén)的α 和β 簇群，目前已從中分離篩選出大量有良好反硝化聚磷能力的菌株[15]。操夢(mèng)穎等[16]對(duì)主流-側(cè)流序批式反應(yīng)裝置中污泥微生物群落組成的研究表明，反硝化優(yōu)勢(shì)菌科占比約39.5%～58.6%，與本研究反硝化優(yōu)勢(shì)菌科占比54.55%～58.57%的結(jié)果相符。

本研究中，MA 組芽單胞菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著高于DG 組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)（P＜0.01）。芽單胞菌是養(yǎng)殖池塘和土壤中常見(jiàn)功能菌群，僅包含芽單胞菌科。芽單胞菌不僅有助于水體的反硝化過(guò)程[17]，而且對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物有益生作用[18]。羅衡等[19]研究稻鱉共作模式的土壤時(shí)發(fā)現(xiàn)，芽單胞菌的相對(duì)豐度與pH 呈顯著正相關(guān)關(guān)系，這與本研究結(jié)果一致。擬桿菌門(mén)是水體環(huán)境中的重要微生物類(lèi)群，屬于化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)菌，是進(jìn)行氧化溶解性有機(jī)物和碳水化合物的主要消費(fèi)者之一，在各種水體環(huán)境中碳循環(huán)過(guò)程中起著重要作用[20-21]。由于微孔管充氣模式顯著提高了養(yǎng)殖水體的溶解氧含量，因此提升了養(yǎng)殖水體中需氧菌群的相對(duì)豐度，進(jìn)而可促進(jìn)養(yǎng)殖水體中的溶解性有機(jī)物和碳水化合物的降解，改善水質(zhì)環(huán)境。

在屬水平上，兩種充氣模式均有較高比例未被檢出的菌屬（DG 組為68.70%，MA 組為79.48%），原因可能是本研究采用的是二代測(cè)序技術(shù)，測(cè)序讀長(zhǎng)較短，導(dǎo)致屬水平的注釋率偏低。在已被鑒定的菌屬中，DG 組厭氧性菌屬和間性厭氧性菌屬的相對(duì)豐度顯著高于MA 組（圖7）。物種和環(huán)境的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Denitratisoma屬和Limnobacter屬與pH 和溶解氧存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖9）。Denitratisoma屬是兩種充氣方式中相對(duì)豐度最高的屬。該屬屬于變形菌門(mén)，是一類(lèi)兼性厭氧反硝化菌屬，具有完整的反硝化途徑，可在微氧條件下利用系統(tǒng)內(nèi)NO3-或NO2

-進(jìn)行反硝化反應(yīng)[22-23]。Limnobacter屬則是具有降解反硝化過(guò)程中N2O 潛能的異養(yǎng)菌[24]，可以緩沖外界環(huán)境對(duì)厭氧氨氧化菌的影響[25]。除Denitratisoma屬和Limnobacter屬外，DG 組還有相對(duì)豐度較高的Fusibacter屬和Lacunisphaera屬菌群。Fusibacter屬是魚(yú)類(lèi)等水產(chǎn)動(dòng)物腸道中常見(jiàn)的間性厭氧性菌類(lèi)，與碳水化合物的發(fā)酵有關(guān)[12,26-27]，而Lacunisphaera屬則與生物膜的產(chǎn)生有關(guān)[28]。李盧國(guó)等[29]對(duì)黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）循環(huán)水系統(tǒng)菌落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，低氧環(huán)境下可發(fā)生活躍的脫氮作用，有利于間性厭氧菌的生長(zhǎng)。因此，厭氧反硝化菌屬在DG 組較高的相對(duì)豐度，可能是本研究中DG 組氨氮含量略低于MA 組的原因之一。此外，本研究在DG 組中還發(fā)現(xiàn)了一定比例的Escherichia-Shigella菌屬（1.37%），其相對(duì)豐度顯著高于MA 組。Escherichia-Shigella屬是常見(jiàn)于水生動(dòng)物腸道內(nèi)的條件致病菌，可引發(fā)宿主腸道疾病[30-31]，但目前也有報(bào)道認(rèn)為Escherichia-Shigella屬可能在廢水脫氮與沼氣脫硫耦聯(lián)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[32]。

本研究中，Sulfuritalea屬、Azospira屬和Tetrasphaera屬相對(duì)豐度顯著高于DG 組，是MA 組已鑒定菌群中的優(yōu)勢(shì)菌屬。Sulfuritalea屬為硫自養(yǎng)反硝化細(xì)菌，在水環(huán)境中可利用H2和單質(zhì)硫等進(jìn)行自養(yǎng)反硝化反應(yīng)[33]，是重要的生物修復(fù)功能菌種[34]。Azospira屬是常見(jiàn)的好氧反硝化細(xì)菌，不僅存在于湖泊等天然水體的沉積物中[35]，也是生物反應(yīng)器中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌群[36-37]。Azospira可將水體中的碳源作為電子供體進(jìn)行反硝化作用，在為其自身生長(zhǎng)提供能量同時(shí)，實(shí)現(xiàn)水體的脫氮[35]。Tetrasphaera屬是一種具有反硝化功能的除磷菌類(lèi)，可利用NOx-N 作為電子受體，降解細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)碳源PHB（聚-β-羥丁酸），并將細(xì)胞外的PO43--P 攝入細(xì)胞內(nèi)，形成多聚偏磷酸鹽，從而實(shí)現(xiàn)同步脫氮除磷的作用[38]。然而，本研究中MA 組和DG 組的磷酸鹽含量差異并不顯著（P ＞0.05），原因可能是Tetrasphaera屬1.17%的相對(duì)豐度尚不足以抵消來(lái)自飼料投喂等磷輸入途徑的作用。

綜上所述，使用微孔管充氣方式可有效提升中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體的溶解氧含量，降低亞硝態(tài)氮含量，提高微生物菌群的多樣性，抑制條件致病菌的生長(zhǎng)，這對(duì)于增強(qiáng)水體的微生物群落穩(wěn)定性，降低病害暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，維持水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)的健康具有積極作用。此外，本研究的結(jié)果初步揭示了中華鱉工廠(chǎng)化養(yǎng)殖水體的水質(zhì)狀態(tài)與微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系，為中華鱉工廠(chǎng)化健康養(yǎng)殖技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化提供了基礎(chǔ)。