董偉然，張燕，安會波，張建偉，周亮

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）屬于RNA病毒，可以通過空氣以及密切接觸傳播，是引起嬰幼兒呼吸道感染最常見的一種病原體，也是引發(fā)全世界范圍內(nèi)嬰幼兒下呼吸道病毒感染的最主要病原體［1］。研究顯示，2～6個月的嬰兒感染RSV后?？梢l(fā)嚴(yán)重毛細(xì)支氣管炎和肺炎，但其引起嚴(yán)重下呼吸道感染的機(jī)制尚不清楚，其有可能是通過呼吸道上皮細(xì)胞間的傳播由上呼吸道播散至下呼吸道所致［2-3］。目前研究表明，嬰幼兒感染RSV后可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂，主要表現(xiàn)為輔助性T淋巴細(xì)胞（T helper cells，Th）1/Th2比例失衡，常呈現(xiàn)出Th2的優(yōu)勢免疫應(yīng)答［4］。白介素13（interleukin-13，IL-13）主要是由活化Th2分泌的一種細(xì)胞因子，可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖、免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）合成、嗜酸粒細(xì)胞生成，進(jìn)而產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，在RSV感染發(fā)病過程中（尤其是感染RSV后喘息的發(fā)作過程中）具有重要作用［5］。CD2為T淋巴細(xì)胞特征性表面標(biāo)志物，與毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）活性相關(guān)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生病原體感染時可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞與其他細(xì)胞結(jié)合，從而擴(kuò)大免疫應(yīng)答反應(yīng)［6］。目前臨床上對于RSV感染主要以對癥治療和支持治療為主，尚無特異性的治療藥物，患兒合并細(xì)菌感染時可聯(lián)合抗菌藥物進(jìn)行治療［7］。布地奈德是糖皮質(zhì)激素類藥物，具有良好的局部抗炎作用，是治療RSV感染的常用藥物［8］。重組人干擾素α-1b是一種通過克隆基因工程研制的干擾素制劑，具有抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用［9-10］。因感染RSV患兒具有免疫功能紊亂的特點，本研究組采用吸入用布地奈德聯(lián)合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預(yù)RSV感染幼鼠模型，并觀察其對幼鼠血清IL-13水平及CD2+T淋巴細(xì)胞占比的影響，以期為臨床治療RSV感染提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 實驗時間為2020-07-23至2020-08-02。

1.2 實驗動物 SPF級Wistar幼鼠32只，雌雄各半，體質(zhì)量為（14±2）g，4周齡左右，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供〔經(jīng)營許可證編號：SCXK（京）200220043〕。

1.3 主要實驗儀器與試劑 RSV Long株病毒液由中國科學(xué)院上海巴斯德研究所提供，重組人干擾素α-1b注射液（購自北京三元基因藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S20010007）、吸入用布地奈德混懸液（購自澳大利亞AstraZeneca Pty Ltd，批準(zhǔn)文號H20140475）均由河北省兒童醫(yī)院藥房提供，IL-13酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，流式細(xì)胞儀（Cytomics Fc 500 MCL）購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及干預(yù)方法 所有幼鼠置于清潔無病原體的鼠籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫為（20±2）℃，相對濕度為40%～60%，晝夜光照節(jié)律為12 h∶12 h，自由飲水、飲食。采用隨機(jī)數(shù)字表法將幼鼠分為空白對照組、陽性對照組、布地奈德組及聯(lián)合用藥組，每組8只。除空白對照組外，其余各組參照文獻(xiàn)［11］，采用滴鼻法建立RSV感染幼鼠模型，幼鼠首先采用7%水合氯醛聯(lián)合七氟烷麻醉，然后經(jīng)鼻腔接種RSV Long株病毒液，0.1 ml/次，1次/d?？瞻讓φ战M在同等條件下接種等量不含RSV Long株病毒液的0.9%氯化鈉注射液，0.1 ml/次，1次/d。均連續(xù)接種3 d，若幼鼠出現(xiàn)發(fā)熱、流涕、喘息、呼吸急促、厭食、蜷臥、豎毛等表現(xiàn)則提示造模成功。參照臨床霧化給藥濃度并根據(jù)人與動物藥物等效劑量進(jìn)行換算配置［12］：從實驗第4天開始，空白對照組和陽性對照組幼鼠給予0.9%氯化鈉溶液霧化干預(yù)（10 g/kg），布地奈德組幼鼠給予吸入用布地奈德混懸液霧化干預(yù)（0.5 mg/次），聯(lián)合用藥組幼鼠給予吸入用布地奈德混懸液（0.5 mg/次）聯(lián)合重組人干擾素α-1b注射液（15 μg/次）霧化干預(yù)。每組幼鼠均每日早晚各霧化干預(yù)1次，連續(xù)霧化干預(yù)5 d。

1.4.2 觀察各組幼鼠一般情況 觀察各組幼鼠霧化干預(yù)后的一般情況，包括呼吸、毛發(fā)、活動、體溫、精神狀況等。

1.4.3 標(biāo)本取材 霧化干預(yù)結(jié)束后通過眼眶靜脈叢采血方法抽取各組幼鼠血液2 ml，于4 ℃下3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取血清，然后置于-40 ℃冰箱冷凍保存。

1.4.4 ELISA雙抗體夾心法檢測血清IL-13水平 采用ELISA雙抗體夾心法檢測各組幼鼠血清IL-13水平，相關(guān)實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.5 流式細(xì)胞儀檢測血清CD2+T淋巴細(xì)胞占比 采用流式細(xì)胞儀檢測各組幼鼠血清CD2+T淋巴細(xì)胞占比，相關(guān)實驗操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠一般情況 本實驗過程中各組幼鼠均未出現(xiàn)死亡情況，其中空白對照組幼鼠毛發(fā)光滑、有光澤，呼吸頻率正常，活動自如，精神狀態(tài)良好，進(jìn)食正常，體溫正常；陽性對照組幼鼠毛發(fā)無光澤、豎立，呼吸急促、喘息，伴有發(fā)熱、寒戰(zhàn)，行動遲緩，精神萎靡或煩躁不安，厭食；布地奈德組和聯(lián)合用藥組幼鼠毛發(fā)光滑、有光澤，呼吸頻率稍快，行動、飲食基本正常，精神狀態(tài)一般。

2.2 四組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細(xì)胞占比比較 四組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細(xì)胞占比比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。陽性對照組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細(xì)胞占比高于空白對照組，布地奈德組、聯(lián)合用藥組幼鼠血清IL-13水平高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；布地奈德組、聯(lián)合用藥組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細(xì)胞占比低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；聯(lián)合用藥組幼鼠血清IL-13水平低于布地奈德組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 四組幼鼠血清IL-13、CD2+ T淋巴細(xì)胞占比比較（±s，n=8）Table 1 Comparison of serum levels of IL-13 and CD2+ T lymphocytes in four groups of young mice

表1 四組幼鼠血清IL-13、CD2+ T淋巴細(xì)胞占比比較（±s，n=8）Table 1 Comparison of serum levels of IL-13 and CD2+ T lymphocytes in four groups of young mice

注：a表示與空白對照組比較，P＜0.05；b表示與陽性對照組比較，P＜0.05；c表示與布地奈德組比較，P＜0.05

組別 IL-13（pg/ml） CD2+ T淋巴細(xì)胞占比（%）空白對照組 4.29±0.26 26.00±0.38陽性對照組 6.97±0.17a 31.84±5.47a布地奈德組 6.16±0.13ab 27.07±1.00b聯(lián)合用藥組 5.39±0.35abc 26.96±1.53b F值 176.74 6.61 P值 ＜0.001 0.002

3 討論

RSV是一種中等大小的、膜包裹的RNA病毒，與副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒等均屬于副黏病毒家族，在受染細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)發(fā)育并且通過胞質(zhì)膜出芽方式成熟［13］。RSV對嬰幼兒的呼吸道有很強(qiáng)的致病力，其可通過空氣飛沫或直接進(jìn)入易感者呼吸道而傳播，也可通過間接接觸患兒呼吸道分泌物污染的物品而傳播，嬰幼兒是RSV感染的易感人群，但新生兒感染RSV也較常見，其是引起新生兒嚴(yán)重下呼吸道感染的最主要病原體，早產(chǎn)兒發(fā)生RSV感染時癥狀更重［14-16］。范麗等［17］對因下呼吸道感染而住院的551例＜1歲嬰兒的RSV感染情況進(jìn)行調(diào)查分析，結(jié)果顯示，感染RSV患兒占所有患兒的31.94%（176/551），其中＜6月齡者占74.43%（131/176），且51.14%（90/176）的患兒同時合并細(xì)菌感染；感染RSV患兒中出現(xiàn)喘息、鼻塞癥狀者明顯多于未感染RSV患兒。袁琳等［14］對309例RSV肺炎新生兒的臨床和流行病學(xué)特點進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，RSV感染存在明顯季節(jié)性，以冬春季為主；早產(chǎn)患兒占總患兒例數(shù)的11.3%（35/309）；患兒早期臨床表現(xiàn)為流涕、鼻塞等上呼吸道感染癥狀，而后可出現(xiàn)咳嗽、喘息，并逐漸加重，重者可有氣促、發(fā)紺，而早產(chǎn)兒則以呼吸暫停和發(fā)紺為主。黃志英等［18］對江蘇省常州地區(qū)的急性呼吸道感染患兒RSV流行病學(xué)情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，RSV是常州地區(qū)引起嬰幼兒急性呼吸道感染的重要病原體，但隨年齡增長其感染率逐漸下降，新生兒RSV的感染率最高。本研究結(jié)果顯示，空白對照組幼鼠毛發(fā)光滑、有光澤，呼吸頻率正常，活動自如，精神狀態(tài)良好，進(jìn)食正常，體溫正常；陽性對照組幼鼠毛發(fā)無光澤，呼吸急促、喘息，伴有發(fā)熱、寒戰(zhàn)，行動遲緩，厭食等，提示RSV感染造模成功。布地奈德組和聯(lián)合用藥組幼鼠毛發(fā)光滑、有光澤，呼吸頻率稍快，行動、飲食基本正常，精神狀態(tài)一般，較陽性對照組明顯好轉(zhuǎn)，提示吸入用布地奈德霧化干預(yù)和吸入用布地奈德聯(lián)合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預(yù)可有效改善RSV感染幼鼠模型癥狀。

鑒于RSV對嬰幼兒健康造成了極大的威脅，WHO已將RSV疫苗的研發(fā)列為首要發(fā)展的疫苗之一［19］。盡管各個國家對RSV疫苗的研制投入了巨大的人力、物力，由于病毒本身的特點和RSV感染人群的特點，目前尚沒有有效的疫苗被批準(zhǔn)應(yīng)用。因此，目前臨床上對于RSV的治療還是以支持治療和對癥治療為主，但由于不同亞型RSV的中和抗體不能提供有效的亞型間交叉保護(hù)作用，RSV感染不能產(chǎn)生完全免疫，故臨床可出現(xiàn)反復(fù)多次感染［20］。重組人干擾素α-1b是我國自主研發(fā)的新型基因工程類藥物，是一種多功能活性蛋白質(zhì)，其雖然并不能直接殺傷或抑制病毒，但可以通過與細(xì)胞表面受體作用，使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復(fù)制，同時還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強(qiáng)抗病毒能力。黃艷嫻等［21］研究表明，RSV可對小鼠酪氨酸蛋白激酶（januskinase，JAK）/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號通路產(chǎn)生抑制作用，而JAK/STAT信號通路對機(jī)體的免疫應(yīng)答、免疫細(xì)胞分化發(fā)育及炎癥反應(yīng)均有重要的調(diào)節(jié)作用，而重組人干擾素α-1b可明顯促進(jìn)STAT1、STAT2蛋白表達(dá)，提高JAK/STAT信號通路的活性，調(diào)節(jié)免疫功能，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用。糖皮質(zhì)激素是一類極其重要的調(diào)節(jié)分子，對機(jī)體的生長、發(fā)育、代謝及免疫功能等起著重要的調(diào)節(jié)作用，是臨床上使用最為廣泛而有效的抗炎和免疫調(diào)節(jié)劑。其中布地奈德是臨床上常用的吸入型糖皮質(zhì)激素，具有快速、強(qiáng)大的非特異性抗炎作用，對各種炎癥反應(yīng)均有療效，在炎癥初期既能抑制毛細(xì)血管擴(kuò)張，減輕滲出和水腫，又能抑制白細(xì)胞的浸潤和吞噬，減輕炎癥癥狀；在炎癥后期能抑制毛細(xì)血管和纖維母細(xì)胞的增殖，延緩肉芽組織的生成，避免粘連等炎癥后遺癥的發(fā)生。布地奈德還有很好的免疫抑制作用，小劑量時主要抑制細(xì)胞免疫，大劑量時能夠抑制漿細(xì)胞和抗體生成，抑制體液免疫功能，減少IgE的分泌。何為［20］認(rèn)為，RSV感染可直接損傷氣道黏膜，導(dǎo)致分泌物增多，并誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答，促進(jìn)炎癥因子分泌，從而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性，出現(xiàn)喘息等癥狀，氣道炎癥反應(yīng)是RSV毛細(xì)支氣管炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，而布地奈德能夠通過與細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)的皮質(zhì)醇受體結(jié)合，阻止炎癥細(xì)胞活化，抑制炎癥因子的合成與釋放，減輕氣道高反應(yīng)性狀態(tài)，從而達(dá)到改善臨床癥狀的目的。郭穎等［22］進(jìn)一步研究布地奈德對RSV感染哮喘模型小鼠肺損傷的保護(hù)機(jī)制，結(jié)果顯示，布地奈德能夠抑制小鼠肺組織中高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）和Toll樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR-4）的表達(dá)，減輕炎癥細(xì)胞浸潤，減少血清和肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞總數(shù)，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子——干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、IL-2的表達(dá)，降低Th2因子——IL-13和嗜酸粒細(xì)胞趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)Th1/Th2恢復(fù)平衡，減輕氣道炎癥。

有研究認(rèn)為，RSV感染引起的免疫功能紊亂是誘發(fā)患兒氣道慢性炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性的主要病理機(jī)制，主要表現(xiàn)為Th1/Th2失衡，并呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢免疫應(yīng)答狀態(tài)，大量可溶性炎性因子被釋放而引起炎癥和組織損傷［23-24］。IL-13是由Th2分泌的一種多效性細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性，活化嗜酸粒細(xì)胞，并驅(qū)使B淋巴細(xì)胞分泌IgE，而IgE是引起哮喘的主要效應(yīng)分子，能夠促進(jìn)氣道黏液的分泌和氣道高反應(yīng)性的形成［25-26］。有研究認(rèn)為，IL-13水平升高是導(dǎo)致患兒感染RSV后發(fā)生喘息甚至哮喘的重要原因，其在哮喘和RSV感染所引起的免疫炎癥反應(yīng)過程中具有十分重要的作用［6，27-28］。常健等［29］研究也表明，IL-13在兒童RSV毛細(xì)支氣管炎轉(zhuǎn)變?yōu)橄倪^程中起主要作用，患兒病情可隨著IL-13水平的降低而減輕。夏虎等［30］研究表明，RSV感染可上調(diào)哮喘模型小鼠氣道上皮細(xì)胞中胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的表達(dá)，促進(jìn)Th2因子——IL-4、IL-5、IL-13等的分泌，加重小鼠肺部Th2型炎癥反應(yīng)。CD2是廣譜且較穩(wěn)定的T淋巴細(xì)胞抗原，表達(dá)于成熟T淋巴細(xì)胞及胸腺細(xì)胞，能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞的黏附，促進(jìn)炎癥反應(yīng)［31］。梁敏等［32］研究表明，負(fù)向調(diào)控CD2相關(guān)蛋白（CD2-associated protein，CD2AP）可以抑制RSV感染導(dǎo)致的支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，從而減輕細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示，陽性對照組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細(xì)胞占比高于空白對照組，布地奈德組、聯(lián)合用藥組幼鼠血清IL-13水平高于空白對照組；布地奈德組、聯(lián)合用藥組幼鼠血清IL-13水平、CD2+T淋巴細(xì)胞占比低于陽性對照組；聯(lián)合用藥組幼鼠血清IL-13水平低于布地奈德組；提示RSV感染幼鼠模型血清IL-13、CD2+T淋巴細(xì)胞占比升高，而吸入用布地奈德霧化干預(yù)和吸入用布地奈德聯(lián)合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預(yù)可降低其血清IL-13水平、CD2+T淋巴細(xì)胞占比，且吸入用布地奈德聯(lián)合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預(yù)的效果更好，這與吳瑩等［33］、范增婧［34］研究結(jié)果基本一致。吳瑩等［33］采用重組人干擾素α-1b聯(lián)合布地奈德霧化吸入治療小兒RSV毛細(xì)支氣管炎，并與單純采用布地奈德霧化吸入治療比較，結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組的總有效率明顯高于對照組（95.75%比78.72%，P＜0.05），且聯(lián)合用藥組治療后肺功能指標(biāo)——吸氣呼氣時間比、每千克體重潮氣量均高于對照組，呼吸阻力小于對照組，并指出聯(lián)合用藥能促進(jìn)Thl/Th2恢復(fù)平衡，減輕氣道炎癥反應(yīng)。范增婧［34］采用重組人干擾素α-1b聯(lián)合布地奈德治療小兒RSV毛細(xì)支氣管炎，并與單純布地奈德治療比較，結(jié)果顯示，聯(lián)合組總有效率明顯高于對照組（96.67%比81.67%，P＜0.05），且聯(lián)合組治療后咳嗽、喘憋、哮鳴音等癥狀緩解時間及住院時間均短于對照組，用力肺活量、第1秒用力呼氣容積均大于對照組，在改善患兒臨床癥狀的同時可有效提高患兒呼吸功能。分析原因，一方面，布地奈德具有抗炎和免疫抑制作用，可誘導(dǎo)抗炎因子合成，抑制炎癥因子合成，減輕氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性；另一方面，重組人干擾素α-1b可調(diào)節(jié)免疫功能，增加機(jī)體的抗病毒能力，抑制病毒復(fù)制，標(biāo)本兼治，從而能夠有效提高治療效果。此外，霧化干預(yù)對于嬰幼兒來說安全性好、治療指數(shù)高，可使藥物直接作用于氣道黏膜上皮細(xì)胞，避免肝臟首過效應(yīng)，能夠更快、更有效地發(fā)揮藥物療效，且霧化吸入藥量較全身用藥量小，可避免或減少糖皮質(zhì)激素全身給藥可能產(chǎn)生的不良反應(yīng)，家屬接受度高，從而提高患兒的治療依從性［35-36］。

綜上所述，吸入用布地奈德聯(lián)合重組人干擾素α-1b注射液霧化干預(yù)可降低RSV感染幼鼠模型血清IL-13水平、CD2+T淋巴細(xì)胞占比，其可能通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能而提高治療效果。但本研究觀察指標(biāo)相對單一，未對深層次的信號通路作用機(jī)制進(jìn)行探討，是否還有其他方面的作用途徑和作用機(jī)制有待將來深入研究。

作者貢獻(xiàn)：周亮進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；張燕、安會波、周亮進(jìn)行研究的實施與可行性分析；張建偉進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理；董偉然、周亮進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋、論文的修訂；董偉然撰寫論文。

本文無利益沖突。