田 翔， 薄 濤， 康 瑜， 劉 超， 喬治軍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因資源研究中心1，太原 030031) (農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2，太原 030031) (山西大學(xué)生物技術(shù)研究所；山西大學(xué)杏花村學(xué)院；化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，太原 030006) (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西功能食品研究院4，太原 030031)

小米是谷子籽粒脫皮后的種仁，含豐富的營養(yǎng)元素，如：碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素以及礦物質(zhì)，且易為人體消化吸收。與玉米、水稻和高粱相比，小米含有更多脂肪酸[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)小米與降低心血管疾病、糖尿病以及某些癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[2, 3]。從小米中能夠提取出種類豐富、具有生物學(xué)活性和潛在藥用價(jià)值的化合物，諸如具有抗菌活性以及抗氧化活性的酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)、木脂素、β-葡聚糖、酯醇、菊糖、色素、膳食纖維和植酸鹽以及蛋白質(zhì)等[1, 4-9]。小米還被認(rèn)為是潛在的益生元食品，調(diào)節(jié)和保護(hù)人體腸道微生態(tài)平衡[1]。此外，小米可作為某些疾病患者的替代主食，例如：攝入富含麩質(zhì)的食品可能導(dǎo)致由免疫系統(tǒng)引起的腸道疾病，而小米不含麩質(zhì)，能夠作為麩質(zhì)敏感人群的替代食品[10]。

由于小米的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值使其品種與產(chǎn)地越來越受到關(guān)注。不同品種與產(chǎn)地小米品質(zhì)以及營養(yǎng)成分不盡相同[11-13]。因此，消費(fèi)者在購買小米時(shí)其真實(shí)品種與產(chǎn)地就顯得尤為重要。隨著國際貿(mào)易增加，消費(fèi)者對(duì)食品真實(shí)產(chǎn)地信息以及安全越來越重視[14]。歐洲自2000年9月已經(jīng)要求將產(chǎn)地來源標(biāo)注在農(nóng)產(chǎn)品上[15]。使用地理標(biāo)簽亦能夠使生產(chǎn)者獲得市場(chǎng)認(rèn)可。鑒于這一原因，新技術(shù)正在逐漸被要求用于確定食品產(chǎn)地與品種[16]。其中，非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析技術(shù)由于能夠通過大規(guī)模數(shù)據(jù)獲得對(duì)樣品的全面認(rèn)識(shí)而得到廣泛應(yīng)用[14]，諸如對(duì)蜂蜜、肉類、水果、茶葉、酒類、乳制品、堅(jiān)果等多種食品代謝指紋圖譜的分析，產(chǎn)地追溯以及品種鑒定[17-23]。然而，對(duì)小米代謝組學(xué)的相關(guān)分析還鮮見報(bào)道。

代謝組學(xué)分析首先需要對(duì)小分子代謝物進(jìn)行提取，提取方法直接影響樣品代謝物提取效率和分析結(jié)果[24, 25]。在動(dòng)植物及微生物細(xì)胞代謝物提取時(shí)，樣品破碎通常采用液氮研磨破碎，以保證代謝物提取過程在低溫下進(jìn)行，減少溫度對(duì)提取代謝物的影響[24]。而植物性食品通常采用機(jī)械粉碎，例如：在對(duì)大米、咖啡豆代謝組學(xué)分析中利用機(jī)械磨將其粉碎成細(xì)小顆粒后提取[26, 27]。此外，食品代謝組分提取的方法有超聲波提取和機(jī)械震蕩提取等[28, 29]。不同提取方法對(duì)于同一對(duì)象的提取效果往往會(huì)存在差異[24]。為研究不同粉碎方式和提取方法對(duì)小米代謝物提取的影響，利用晉谷59號(hào)小米作為研究對(duì)象，基于GC-MS技術(shù)比較了機(jī)器粉碎與液氮研磨對(duì)小米小分子提取的影響，探討了超聲波提取、低溫靜置孵育、機(jī)械振蕩及反復(fù)凍融等不同提取方案對(duì)小米小分子代謝物分析的影響。為小米等粟類農(nóng)產(chǎn)品代謝指紋圖譜分析、產(chǎn)地追溯以及品種鑒定等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

晉谷59號(hào)小米：2020年產(chǎn)于山西省忻州市，粒徑均勻，顏色金黃，籽粒千粒重2.67 g，水分9.09 g/100 g，總淀粉75.01 g/100 g，脂肪3.10g/100 g，粗蛋白質(zhì)12.13 g/100 g，纖維素2.62 g/100 g，灰分1.30 g/100 g，黃色素26.35 mg/kg。采樣后冷凍干燥后放入-80 ℃冰箱保存。色譜級(jí)甲醇，吡啶、氘標(biāo)記丁二酸(succinic acid,d4)、甲氧基胺鹽酸鹽(O-Methylhydroxylamine hydrocholoride)和N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)、超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890A-5795C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，HP-5色譜柱， ALPHA 1-4 LD真空冷凍干燥機(jī)，Eppendorf 5430R冷凍離心機(jī)，Tissulyser Ⅱ高通量組織冷凍研磨儀，Cyclotec1093旋風(fēng)磨，Millipore超純水機(jī)，XMTB電熱恒溫水浴鍋，QL-902旋渦混合器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小米代謝物提取

參考前人方法提取小米代謝物[30, 31]，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行重復(fù)。根據(jù)小米樣品研磨破碎及代謝物提取方法不同分為4組。

方法1：通過液氮預(yù)冷的粉碎機(jī)粉碎30 s，重復(fù)兩次獲得小米粉；稱取50 mg小米粉加入1 mL 50%甲醇提取液混合渦旋1 min；之后常溫下以頻率40 kHz、功率70%水浴超聲提取5 min；

方法2：液氮冷凍條件下在研缽中研磨小米10 min；冷凍狀態(tài)下稱取50 mg小米粉，加入1 mL 40 ℃預(yù)冷的50%甲醇提取液混合渦旋1 min；通過組織研磨儀提取小分子代謝物，研磨90 s，2次，中間間歇90 s；

方法3：通過液氮預(yù)冷的粉碎機(jī)粉碎30 s，重復(fù)兩次獲得小米粉；稱取50 mg小米粉加入1 mL 40 ℃預(yù)冷的50%甲醇提取液混合渦旋1 min，4 ℃ 12 h過夜浸提，之后通過液氮反復(fù)凍融5次提取小分子代謝物；

方法4：通過液氮預(yù)冷的粉碎機(jī)粉碎30 s，重復(fù)兩次獲得小米粉；稱取50 mg小米粉加入1 mL 40 ℃預(yù)冷的50%甲醇提取液混合渦旋1 min，液氮凍融與組織研磨結(jié)合提取小分子代謝物，操作條件同方法2與方法3。

提取完成后12 000 r/min離心10 min收集上清液。取200 μL提取液，加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液(氘標(biāo)記琥珀酸1.6 mg/mL)，渦旋混勻，真空冷凍干燥機(jī)凍干。

1.3.2 樣品衍生化

在GC-MS分析前，參考Bo等[31]方法對(duì)樣品進(jìn)行衍生化操作。

1.3.3 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析

主要色譜與質(zhì)譜條件參考Bo等[31]。

1.3.4 代謝物定性定量方法

采用MSD 高效化學(xué)工作站軟件(version E.02 01.1177)與AMDIS進(jìn)行去卷積分析質(zhì)譜峰。通過與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所(NIST 2011)質(zhì)譜庫匹配，對(duì)質(zhì)譜峰進(jìn)行定性。峰的歸一化是通過所有峰面積與內(nèi)標(biāo)化合物氘標(biāo)記琥珀酸的峰面積相比實(shí)現(xiàn)的，之后利用標(biāo)準(zhǔn)化后的峰面積進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)：將歸一化峰面積(變量)輸入SIMCA軟件(Simca-P 14，Umetrics，San Jose，Calif)分析。層次聚類分析(HCA)利用HCE(3.5 USA)軟件進(jìn)行層次聚類分析。通過R語言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行清洗，R語言ggplot包與Origin2018對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化呈現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同預(yù)處理方法對(duì)小米代謝物提取效果的影響

用4種不同預(yù)處理方法進(jìn)行小米代謝物提取，基于GC-MS檢測(cè)，4種處理組檢測(cè)到的化合物峰信號(hào)分別為292、326、318和309。1、3、4處理組鑒定出57種小分子代謝物，處理組2相較于另外3種預(yù)處理方法少鑒定出3種代謝物，分別為天冬酰胺、葡萄糖內(nèi)脂, 5-甲氧胺和赤蘚糖醇。此外，2種未能定性的化合物在處理組2中也未能檢出。造成這一結(jié)果的原因可能是粉碎方法不同。處理組2中采用液氮研磨粉碎，而另外3組采用機(jī)器粉碎。雖然方法2能夠保證小米代謝物提取全程低溫，有效降低了溫度對(duì)代謝物的影響，但是其對(duì)小米的粉碎度不及機(jī)器。通過機(jī)器粉碎的小米粉末更為細(xì)膩，這可能使后續(xù)代謝物提取時(shí)小分子代謝物更容易被萃取。通過對(duì)不同處理組代謝物峰進(jìn)行對(duì)數(shù)比分析發(fā)現(xiàn)不同處理組之間相比峰強(qiáng)度存在顯著變異(如圖1)。這些結(jié)果表明不同預(yù)處理處理方法對(duì)小米代謝物的提取結(jié)果具有顯著影響。

2.2 小米不同預(yù)處理方法非靶標(biāo)代謝組學(xué)結(jié)果的多元統(tǒng)計(jì)分析

為進(jìn)一步分析不同預(yù)處理方法對(duì)小米小分子代謝物提取效率的影響，對(duì)4種不同預(yù)處理組的檢出峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督主成分分析(PCA)、層次聚類分析以及有監(jiān)督偏最小二乘判別分析(PLS-DA)。在PCA和PLS-DA得分圖中(圖2和圖3a)，4種不同處理組樣本展現(xiàn)出明顯的離散性，其中處理組2與另外3個(gè)處理組樣本存在顯著差異。層次聚類分析(HCA)結(jié)果也顯示處理組2單獨(dú)聚為一類，其他3種方法聚為一類(圖4)，進(jìn)一步證實(shí)了PCA和PLS-DA的分析結(jié)果。原因如前分析，粉碎小米方式會(huì)對(duì)小米代謝物提取產(chǎn)生顯著影響。此外，PCA與PLS-DA得分圖顯示處理組3的平行樣品更加離散，而處理組1和處理組4更加聚集，這表明處理組1和處理組4的重復(fù)性和穩(wěn)定性更好；熱圖結(jié)果也表明小米不同預(yù)處理方法對(duì)不同種類代謝物萃取有不同的偏愛性。通過PLS-DA進(jìn)一步分析能夠找到造成不同處理組差異的10種標(biāo)志代謝物，依次為蔗糖、硬脂酸、麥芽糖、葡萄糖胺、棕櫚酸、丙三醇、葡萄糖、半乳糖、羥胺、1,2,3-丙三羧酸，這些標(biāo)志代謝物的VIP值大于1(圖3b)。處理組2對(duì)3種糖類Maltose、D-Glucose、D-Galactos以及Hydroxylamine的提取效率高于其他3個(gè)處理組(圖5)。與處理組3和處理組4相比，處理組1中硬脂酸、麥芽糖、葡萄糖胺、葡萄糖、羥胺含量更高，除棕櫚酸外，其他代謝物含量與處理組3和處理組4相似；因此，處理組1對(duì)10種標(biāo)志代謝物的提取效果總體而言相較于處理組3、處理組4更好(圖5)。處理組1與處理組3和處理組4在操作上的區(qū)別主要是對(duì)提取樣品進(jìn)行了超聲波處理以及在代謝物萃取時(shí)全程常溫進(jìn)行，而處理組3和處理組4在低溫下進(jìn)行，亦沒有進(jìn)行超聲波處理，這可能是造成提取結(jié)果差異的主要原因。在對(duì)人血清和綠豆種子小分子代謝物提取的過程中均發(fā)現(xiàn)超聲波處理能夠有效提升提取效率[25, 32]。在利用乙醇從粉粹的葡萄藤中固液萃取反式白藜蘆醇，反式葡萄素、阿魏酸和總酚的研究中發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高反式白藜蘆醇，反式葡萄素和總酚的萃取效率顯著提高[33]。在利用美洲無瓣紫檀種子和蘆筍渣為原料固液萃取抗氧化化合物的研究中，可知在一定范圍內(nèi)提高溫度能夠顯著提高萃取效率[34, 35]。這些研究結(jié)果與本研究結(jié)果相一致。

注：圖中每個(gè)色點(diǎn)代表2個(gè)處理組峰強(qiáng)度均值比值的自然對(duì)數(shù)，其中紅色色點(diǎn)代表2個(gè)處理組峰強(qiáng)度均值比值大于1，黑色色點(diǎn)代表2個(gè)處理組峰強(qiáng)度的比值等于1，綠色色點(diǎn)代表2個(gè)處理組峰強(qiáng)度的比值小于1。

注：置信區(qū)間為95%，在圖中用橢圓表示。圖2 不同預(yù)處理方法小米小分子代謝物主成分分析得分圖

注：置信區(qū)間為95%，在圖中用橢圓表示。圖3 不同預(yù)處理方法小米代謝指紋偏最小二乘判別分析

圖4 不同預(yù)處理方法小米代謝指紋層次聚類分析

圖5 不同預(yù)處理小米差異代謝物相對(duì)含量比較

前人研究認(rèn)為，在一定范圍內(nèi)溫度升高能夠通過提升傳質(zhì)效率與萃取物溶解度促進(jìn)萃取物的提取[34, 36]。這一結(jié)論支持了本研究結(jié)果原因分析。

圖6 小米不同類型代謝物相對(duì)含量比較

2.3 基于GC-MS的小米代謝指紋圖譜分析

基于之前的結(jié)果分析，與預(yù)處理方法1相比，方法2提取代謝物種類較少，方法3重復(fù)性和穩(wěn)定性較差，方法4對(duì)標(biāo)志代謝物的提取效率較低。因此，預(yù)處理方法1是提取小米代謝物的最佳方案，對(duì)采用該方法的小米代謝指紋進(jìn)行分析。通過GC-MS指認(rèn)出的小米代謝物分為以下幾類：氨基酸、糖、脂肪酸、有機(jī)酸、胺類、醇類、糖苷類以及其他。其中糖類和脂肪酸含量所占比例最大(圖6)。對(duì)代謝物檢出種類分析發(fā)現(xiàn)氨基酸檢出10種、糖類9種、有機(jī)酸11種、脂肪酸和糖苷類化合物5種、胺類和醇類化合物6種、其他化合物12種。在之前的報(bào)道中，小米富含18種氨基酸[12]，而在本研究中檢出10種氨基酸，這主要因?yàn)闃悠奉A(yù)處理方法不同。在之前的報(bào)道中，對(duì)小米氨基酸的分析首先需要將小米蛋白進(jìn)行水解，得到游離氨基酸[12]。而本研究的目標(biāo)是對(duì)小米進(jìn)行非靶標(biāo)代謝組學(xué)分析，直接通過固液萃取的方式提取小米小分子代謝物，并未對(duì)小米蛋白進(jìn)行水解，因此檢出氨基酸種類和相對(duì)含量與之前報(bào)道不同。對(duì)同類型代謝物相對(duì)含量進(jìn)行分析，在檢出的10種氨基酸中脯氨酸與N-乙酰賴氨酸相對(duì)含量最高，谷氨酸和天冬氨酸次之；糖類中蔗糖相對(duì)含量最高，半乳糖與葡萄糖次之，其他種類的糖含量相似；有機(jī)酸中1,2,3-丙三羧酸相對(duì)含量最高，丁二酸次之；脂肪酸中硬脂酸與棕櫚酸相對(duì)含量較高；醇類中丙三醇含量最高；胺類Androst-2-En-17-Amine含量最高，葡萄糖胺次之；糖苷類Glycoside與吡喃葡萄糖苷相對(duì)含量較高。

本研究基于GC-MS從小米中共鑒定出57種小分子代謝物，與其他食品基于GC-MS鑒定出的代謝物數(shù)量相似(圖7)，例如在紅小豆(Adzuki bean)、大米種子(Riceseed)以及天培(Tempe)中分別鑒定出56、48、58種小分子代謝物[14, 30, 37]。比較上述報(bào)道檢出和鑒定出的代謝物種類數(shù)，本研究對(duì)小米小分子代謝物的提取效率良好。將從這4種食品中鑒定出的代謝物種類進(jìn)行比較，共有代謝物是三種氨基酸，天冬酰胺、谷氨酸和脯氨酸。小米獨(dú)有代謝物有38種。小米單獨(dú)與紅小豆、大米種子以及天培相比，小米獨(dú)有代謝物數(shù)量分別為44、48和49種?；贕C-MS檢測(cè)平臺(tái)，不同食品樣品鑒定出的代謝物種類存在較大差異。這一結(jié)果表明不同食品的代謝指紋顯著不同，同時(shí)也表明基于GC-MS的非靶標(biāo)代謝指紋分析是鑒定食品代謝指紋的有效手段。

圖7 基于GC-MS代謝組學(xué)分析不同食品代謝物種類比較

3 結(jié)論

本研究采用基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)評(píng)估了不同預(yù)處理方法對(duì)小米代謝物分析的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同預(yù)處理方法對(duì)于小米代謝物提取的覆蓋度和信號(hào)強(qiáng)度有顯著影響；通過機(jī)器粉碎小米的處理組1、處理組3和處理組4對(duì)代謝物提取效果要優(yōu)于手動(dòng)液氮研磨的處理組2；在后續(xù)代謝物固液萃取中處理組1提取代謝物的穩(wěn)定性和信號(hào)強(qiáng)度要好于處理組3和處理組4。因此，處理組1為小米小分子代謝物提取的最優(yōu)方案。利用該方案，基于GC-MS的代謝組學(xué)技術(shù)鑒定出包括氨基酸、糖類、有機(jī)酸、脂肪酸、醇類、胺類、糖苷類7類小分子代謝物，共計(jì)57種。本研究為小米等粟類農(nóng)產(chǎn)品代謝指紋圖譜分析、產(chǎn)地追溯以及品種鑒定等提供了方法與數(shù)據(jù)參考。