邱展英， 李琳何， 范方舒， 吳衛(wèi)國(guó),， 凌 閩， 張 喻,

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院1，長(zhǎng)沙 410128) (湖南省菜籽油營(yíng)養(yǎng)健康與深度開發(fā)工程技術(shù)研究中心2，長(zhǎng)沙 410128)

菜籽油是世界三大植物油之一，是我國(guó)食用油的重要來(lái)源，占國(guó)內(nèi)食用油銷售總量的50%[1]。我國(guó)菜籽油的傳統(tǒng)制取方法主要有壓榨法、溶劑浸出法[2]。目前工業(yè)上常采用預(yù)榨-浸出法制取菜籽油，由于炒制和壓榨等預(yù)處理溫度較高，容易導(dǎo)致菜籽油中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。此外，溶劑浸提法還存在溶劑殘留問題[3,4]。水酶法作為一種新興的提油工藝，相比于傳統(tǒng)提油方法，其提取條件溫和，綠色環(huán)保，所得油脂品質(zhì)高，同時(shí)，可獲得低變性且無(wú)毒的蛋白質(zhì)，目前已成為研究熱點(diǎn)[5-7]。

在水酶法提油工藝中，常用的酶主要有纖維素酶、半纖維素、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶以及復(fù)合酶等[8,9]。其中復(fù)合酶具有多種酶的不同活性，各活性之間有協(xié)同作用，更有利于細(xì)胞壁的破裂，以釋放油脂，因此提油效果比單一酶好[10-12]。陶海英等[13]研究了單一酶及復(fù)合酶對(duì)小麥胚芽油提油率的影響，得到以酸性蛋白酶和纖維素酶為主的復(fù)合酶提油效果最好，提油率可達(dá)65.53%。周玥等[14]對(duì)水酶法提取茶籽油的復(fù)合酶制劑配方及酶解工藝進(jìn)行了研究，得到高溫淀粉酶結(jié)合酸性蛋白酶在最優(yōu)酶解條件下提油率最高，達(dá)92.45%。令玉林等[15]對(duì)水酶法提取菜籽油與菜籽蛋白的酶解工藝參數(shù)進(jìn)行研究，確定了纖維素酶和果膠酶配比的復(fù)合酶處理效果較好，破乳后油脂的總提取率為92.6%。油料不同所使用的酶種類與配比也不一樣，酶的種類及用量應(yīng)根據(jù)油料的種類、主要成分、含油率及制油方式等條件來(lái)選擇[16]。此外，在酶解過程中，酶解溫度、酶解時(shí)間、料液比、酶解pH和酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)等因素對(duì)酶解效果也有很大的影響。

因此，本實(shí)驗(yàn)以擠壓預(yù)處理后的油菜籽為原料，在對(duì)復(fù)合酶制劑中酶種類進(jìn)行篩選以及混料設(shè)計(jì)優(yōu)化配比的基礎(chǔ)上，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究不同酶解條件對(duì)水酶法提取油菜籽清油提油率的影響，確定最佳的復(fù)合酶配比及酶解工藝參數(shù)，以期為水酶法技術(shù)在油菜籽中的工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

油菜籽：香油Ⅰ號(hào)。

纖維素酶(酶活≥400 U/mg)、果膠酶(≥500U/mg)、中性蛋白酶(酶活10萬(wàn)U/g)、堿性蛋白酶(酶活≥200 U/mg)、α-淀粉酶(酶活≥4 000 U/g)、木聚糖酶(酶活≥6 000 U/mg)；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

FMHE36-24R型雙螺桿擠壓膨化機(jī)，SHZ-B型恒溫水浴振蕩器，DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋，TDZ5型臺(tái)式低速離心機(jī)，KQ5200型超聲波清洗器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菜籽油的提取工藝

油菜籽→清理粉碎→雙螺桿擠壓→水酶法酶解→滅酶→離心→吸取上清油→干燥→菜籽油

具體操作要點(diǎn)：油菜籽粉碎過40目篩，擠壓膨化機(jī)設(shè)定套筒溫度為90 ℃、喂料量為12 kg/h、物料加水量為10%、螺桿轉(zhuǎn)速為210 r/min，其中，擠壓膨化機(jī)處理物料方式為常溫進(jìn)量，中段加熱，最后階段出料溫度小于50 ℃。取20.0 g擠壓后的菜籽于250 mL錐形瓶中，按照不同的料液比加入溫度為70～80 ℃、不同pH的熱緩沖液，將原料攪拌均勻，放入60 ℃的水浴鍋中浸提1 h。取出樣品置于室溫下，將其溫度降至40 ℃左右，稱取不同添加量的酶加入樣品，混勻后置于恒溫水浴振蕩器中酶解，酶解結(jié)束后取出，在水浴鍋中以90 ℃滅酶20 min。將其離心吸取上清油，在90 ℃的烘箱中烘1 h，稱量計(jì)算清油提取率。

1.3.2 清油提取率的計(jì)算

清油提取率計(jì)算公式為：

式中：Y為清油提取率/%；m0為菜籽酶解后所得清油的質(zhì)量/g；m1為菜籽的質(zhì)量/g；m2為擠壓后油菜籽含油率/%。

1.3.3 酶種類的篩選

在料液比1∶5、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%、酶解時(shí)間4 h、每種酶最適的溫度和pH條件下，選用6種不同的酶對(duì)油菜籽進(jìn)行處理，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。根據(jù)提油率篩選出適宜提油的酶制劑種類。所用酶的種類、最適溫度及pH見表1。

表1 6種酶的最適pH及溫度

1.3.4 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)優(yōu)化復(fù)合酶的配比

基于單一酶對(duì)提油率的影響，選擇中性蛋白酶、果膠酶和α-淀粉酶3種酶作為復(fù)合酶的目標(biāo)酶。設(shè)定酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間4 h、酶解pH 6、料液比1∶5、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，按照Design-expert 8.06混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)3種酶的不同混合比例進(jìn)行優(yōu)化，確定3種酶的適宜配比。

1.3.5 復(fù)合酶酶解條件的確定1.3.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間4 h、酶解pH 6、料液比1∶5和復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的條件下，分別以酶解溫度40、45、50、55、60 ℃，酶解時(shí)間2、3、4、5、6 h，酶解pH 4、5、6、7、8，料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、1.5%、2%、2.5%、3%為單因素，探究不同的酶解條件對(duì)提油率的影響。

1.3.5.2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化最佳酶解條件

在單因素實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取酶解溫度(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解pH(C)、料液比(D)和復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)(E)作為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的5個(gè)自變量，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立提油率(Y)與自變量之間的函數(shù)關(guān)系，得到復(fù)合酶法酶解油菜籽的最佳條件。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件，圖形制作采用Excel和Origin 2018數(shù)據(jù)處理軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的篩選

酶具有專一性，不同的酶在提取油脂的過程中產(chǎn)生的效果不同。根據(jù)油菜籽的主要成分及已報(bào)道的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、果膠酶、纖維素酶6種酶，并在各不同酶的最適條件下對(duì)擠壓后的油菜籽進(jìn)行酶解提油，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。當(dāng)酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，不同種類的酶在各自較適宜的酶解條件下對(duì)菜籽油的提取率差異較大，使用堿性蛋白酶和中性蛋白酶提取效果最好，其次是果膠酶和α-淀粉酶，木聚糖酶、纖維素酶提取效果較低。這說(shuō)明油菜籽中油脂與蛋白質(zhì)結(jié)合的最多，蛋白酶能對(duì)脂質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行降解，促使油脂和蛋白質(zhì)的分離[17]。原料經(jīng)過擠壓之后，油料的顆粒分子結(jié)構(gòu)被破壞，可能導(dǎo)致菜籽組分中的部分不溶性纖維轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄岳w維，所以使用纖維素酶酶解效果較差[18]。中性蛋白酶與堿性蛋白酶對(duì)菜籽油提油率的影響不顯著，而油料在堿性條件下進(jìn)行酶解容易導(dǎo)致油脂皂化，因此選擇酶解條件相近的中性蛋白酶、果膠酶和α-淀粉酶這3種酶為復(fù)合酶的目標(biāo)酶。

圖1 不同酶對(duì)提油率的影響

2.2 D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 混料實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

設(shè)定中性蛋白酶(F)、果膠酶(G)和α-淀粉酶(H)這3種酶的添加比例在0.1～1之間，且三者添加比例之和為1，以3種酶的添加比例為自變量，提油率為因變量，采用Design-expert 8.06軟件中混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定實(shí)驗(yàn)因素空間內(nèi)的候選點(diǎn)，組成16個(gè)模型組合，確定復(fù)合酶中3種酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3 混料實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

應(yīng)用分析軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到Y(jié)與F、G和H之間的二次多元回歸方程為：

Y=76.16F+56.77G+71.85H+66.74FG-6.29FH+16.40GH+270.92FGH+12.52FG(F-G)+246.95FH(F-H)-24.77GH(G-H)

2.2.2 混料實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷娘@著性分析

表4 回歸方程的方差分析結(jié)果

以擠壓后油菜籽提油率(Y)為響應(yīng)值，繪制3個(gè)自變量之間交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖，如圖2所示。3種酶線性混合交互作用達(dá)到了極顯著水平(P<0.000 1)，當(dāng)中性蛋白酶用量高，果膠酶和α-淀粉酶用量較少時(shí)，油菜籽提油率約為80%；當(dāng)果膠酶用量高，中性蛋白酶和α-淀粉酶用量較少時(shí)，提油率為60%左右；當(dāng)α-淀粉酶用量很高，中性蛋白酶和果膠酶用量較少時(shí)，提油率為50%左右。這表明在酶解過程中，中性蛋白酶占主導(dǎo)地位，果膠酶和α-淀粉酶對(duì)提油率都有一定的影響。因此在酶解過程中，將3種酶進(jìn)行合適的配比所組成的復(fù)合酶體系之間可產(chǎn)生協(xié)同作用，顯著提高油菜籽提油率。

圖2 3種酶交互作用對(duì)菜籽油提油率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過 Design expert 8.06軟件求解方程，得出中性蛋白酶、果膠酶、α-淀粉的配比為0.573∶0.315∶0.112，理論提油率為87.840%。為驗(yàn)證該配比的可靠性，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，提油率的平均值為 87.624%，與理論預(yù)測(cè)值基本吻合。這也表明使用中性蛋白酶、果膠酶、α-淀粉酶按比例組成的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，其酶解效果要顯著高于單一酶的酶解效果。

2.3 復(fù)合酶酶解條件的確定

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.3.1.1 酶解溫度對(duì)提油率的影響

固定其他參數(shù)不變，探究酶解溫度對(duì)提油率的影響，結(jié)果如圖3所示。提油率隨酶解溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)提油率最高。呈現(xiàn)這種趨勢(shì)的主要原因是大多數(shù)酶對(duì)熱敏感，溫度較低時(shí)不易催化酶的活性，但當(dāng)溫度過高時(shí)容易導(dǎo)致酶變性失活[19]。酶的催化功能主要取決于酶分子結(jié)構(gòu)的完整及嚴(yán)格的構(gòu)象，在一定范圍內(nèi)升高溫度，可以使酶的分子構(gòu)象發(fā)生改變，增加分子的動(dòng)能，促進(jìn)擴(kuò)散作用，有利于酶解的進(jìn)行[20]。但當(dāng)溫度升高到一定程度，高溫使酶的分子結(jié)構(gòu)被破壞，逐漸失去催化活性，從而導(dǎo)致提油率降低[19,21]。所以酶解溫度選擇50 ℃較為合適。

圖3 復(fù)合酶酶解條件對(duì)提油率的影響

2.3.1.2 酶解時(shí)間對(duì)提油率的影響

酶解時(shí)間的長(zhǎng)短決定了酶對(duì)底物的作用程度。固定其他參數(shù)不變，探究酶解時(shí)間對(duì)提油率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。 酶解時(shí)間1～4 h的范圍內(nèi)，提油率隨酶解時(shí)間的增長(zhǎng)呈不斷上升的趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到4 h后增加較為緩慢。酶解反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，酶解反應(yīng)越充分，較多的油脂被釋放出來(lái)，油脂的提油率也就越高。酶解4 h之后，基本達(dá)到完全酶解的狀態(tài)，而時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)蛋白質(zhì)被逐漸分解成分子量更小的肽類，在不斷振蕩過程中部分油脂發(fā)生乳化，故提油率有所降低[16]。而且時(shí)間過長(zhǎng)還會(huì)造成油脂的氧化，油脂的品質(zhì)下降[22]。所以酶解時(shí)間選擇4 h較為適宜。

2.3.1.3 酶解pH對(duì)提油率的影響

pH是影響水酶法提油的關(guān)鍵因素之一，主要通過影響酶的活性和油脂與蛋白質(zhì)的分離來(lái)影響提油率的大小[23]。固定其他參數(shù)不變，探究酶解pH對(duì)提油率的影響，結(jié)果見圖3。在酶解pH 4～8之間，提油率隨酶解pH的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶解pH 6時(shí)提油率達(dá)到最高。其原因可能是pH 影響了酶的活性，酸或堿能夠改變酶的空間結(jié)構(gòu)，影響了底物與酶結(jié)合后復(fù)合物的離解，從而影響了酶解產(chǎn)物和酶的釋放[16]；在一定范圍內(nèi)，隨著pH的增加，菜籽蛋白溶解度增大，蛋白結(jié)構(gòu)疏松，油脂容易流出[24]。所以該復(fù)合酶選擇酶解pH 6較為合適。

2.3.1.4 料液比對(duì)提油率的影響

固定其他參數(shù)不變，探究料液比對(duì)提油率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。當(dāng)料液比在1∶(3～4)的范圍內(nèi)，隨著溶劑用量的增大，提油率呈明顯上升的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)料液比為1∶4時(shí)最高，提油率達(dá)到89.980%。其原因主要是隨著溶液用量的增加，酶能更充分的作用于底物，底物濃度剛好達(dá)到酶促反應(yīng)速度最大值，此時(shí)提油率最高[25]。但是溶劑用量過大，酶和底物的作用面積減小，不利于酶的作用。所以結(jié)合生產(chǎn)成本和工廠生產(chǎn)的可能性，在保證原料底物與酶充分接觸的情況下，盡可能的減少溶劑的用量。所以料液比選擇1∶4較為合適。

2.3.1.5 復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提油率的影響

酶添加量會(huì)影響酶和底物的接觸面積，進(jìn)而影響酶解速率。固定其他參數(shù)不變，探究復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提油率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0%～2%的范圍內(nèi)，隨著復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，油菜籽的提油率不斷增加，且增幅較大；當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%后，菜籽油提油率增加幅度減緩。其原因可能是反應(yīng)體系中復(fù)合酶的添加量趨于飽和，底物的接觸位點(diǎn)不能充分暴露出來(lái)，因此過量的酶無(wú)法和底物發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致提油效果升高緩慢[26]。此外，復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，在工業(yè)化生產(chǎn)中會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本大幅增加，所以當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～3%，提油效果均較好時(shí)，選擇復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%較為合適。

2.3.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Design-Expert 8.06實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH、料液比和復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量，提油率作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了五因素三水平共46個(gè)點(diǎn)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，取平均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，方差分析見表6。

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.06對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，對(duì)提油率(Y)與酶解溫度(A)、酶解時(shí)間(B)、酶解pH(C)、料液比(D)、復(fù)合酶添加量(E)之間建立二次響應(yīng)面回歸模型為：

Y=92.35-2.42A+1.71B+0.24C+0.53D+1.91E-2.61AB-1.08AC-5.26AD+2.22AE-3.75BC+0.75BD+0.12BE-4.97CD-1.56CE-1.80DE-17.07A2-0.85B2-7.24C2-4.80D2-2.57E2

所得模擬方程具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為R2=0.994 4。此外為了考察模型的擬合度，對(duì)模型進(jìn)行了ANOVA方差分析，分析結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

表6 二次多項(xiàng)式模型方差分析

根據(jù)Box-Behnken模型響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果，得出最優(yōu)提取工藝參數(shù)為酶解溫度49.08 ℃、酶解時(shí)間4.05 h、酶解pH 6.03、料液比1∶4.09、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.27%，此時(shí)菜籽的油脂提取率為92.378%。為便于操作，確定最佳的提取工藝參數(shù)為：酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間4 h、酶解pH 6、料液比1∶4、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%。為證實(shí)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的可靠性，對(duì)該酶解條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在此條件下提油率分別93.124%、92.457%、91.417%，平均值為92.333%，與理論值92.378%基本一致。說(shuō)明通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得到復(fù)合酶法提菜籽油的工藝條件是可靠的。

3 結(jié)論

以提油率為考察指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)篩選出中性蛋白酶、果膠酶和α-淀粉酶為復(fù)合目標(biāo)酶。在此基礎(chǔ)上，利用D-最優(yōu)混料設(shè)計(jì)確定中性蛋白酶、果膠酶和α-淀粉酶的最佳配比為0.573∶0.315∶0.112時(shí)提油效果好，為87.624%。結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和方差分析，確定了酶解工藝參數(shù)對(duì)提油率影響的大小順序?yàn)椋好附鉁囟?復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)>酶解時(shí)間>料液比>酶解pH，其中酶解溫度、酶解時(shí)間和復(fù)合酶添加量對(duì)提油率的影響極顯著；最佳酶解工藝條件為酶解溫度50 ℃、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、酶解時(shí)間4 h、料液比1∶4、酶解pH 6，在此條件下，水酶法提油率的模型預(yù)測(cè)值為92.378%，而實(shí)測(cè)值為92.333%，二者接近，這表明通過Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)所得到復(fù)合酶法提菜籽油的工藝條件是可靠的。