柳麗, 杜中平, 李屹, 陳來生, 韓睿

（青海大學農林科學院, 青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室, 西寧 810016）

青稞是我國青藏高原的特色優(yōu)良作物, 具有適應性強、抗逆性強和易栽培等優(yōu)點, 在高寒地區(qū)的糧食種植中占據重要地位, 現已成為青藏高原農牧民的主要糧食和經濟來源[1]。目前, 青藏高原常年種植青稞面積已達300多萬hm2, 并且逐年增加[2]。隨著青稞種植面積的擴增, 其收獲后的廢棄秸稈也在不斷增多, 僅青海省的秸稈年產量就達30萬t, 秸稈資源量十分豐富。青稞秸稈中富含氮、磷、鉀等多種營養(yǎng)元素和有機物質, 具有較高的再利用價值[3]。然而, 目前除部分用作飼料外, 更多的卻未得到有效利用, 就地填埋、隨意焚燒的現象仍普遍存在, 造成極大的資源浪費和環(huán)境污染。

厭氧發(fā)酵是秸稈等農業(yè)廢棄物資源化利用的有效技術手段, 不僅能夠有效解決廢棄物堆棄問題, 還能生產出沼氣等能源物質。然而秸稈中緊密的木質纖維素結構嚴重阻礙了厭氧發(fā)酵底物的消化分解, 導致秸稈的生物可降解性不高[4]。因此, 有必要對青稞秸稈進行適當的預處理。在眾多對秸稈的化學預處理方法中, NaOH是一種常見、廉價且效果顯著的預處理試劑, 現已被廣泛應用于各種秸稈厭氧發(fā)酵的預處理[5-7]。覃國棟等[8]研究發(fā)現, NaOH預處理可以降解稻草中半纖維素組分, 顯著提高甲烷產量。Zhu等[9]發(fā)現5%NaOH固態(tài)預處理玉米秸稈的產氣量最高, 為372.4 L·kg-1, 較對照提高了37%。Liang等[10]和Rezaei等[11]分別發(fā)現4% NaOH和1% NaOH預處理對玫瑰莖稈和黑麥秸稈厭氧消化效果較好, 產氣量分別達到了117.7和121 mL·g-1。現階段, 我國關于秸稈厭氧消化的研究大多集中在糧食作物秸稈上, 特別是對小麥[12]、玉米[13]和水稻[14]等作物的秸稈研究較多, 青稞秸稈諸多理化性質類似于小麥秸稈, 卻鮮有報道。因此, 本文以廢棄的青稞秸稈作為發(fā)酵底物, 研究不同NaOH預處理條件對青稞秸稈厭氧發(fā)酵性能的影響, 以期探討NaOH在青稞秸稈厭氧發(fā)酵應用中的可行性, 為青藏地區(qū)青稞秸稈資源化利用提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青稞秸稈取自青海大學農林科學院實驗地。自然條件下風干后, 用粉碎機粉碎至粒徑2 cm左右, 于陰涼通風處保存?zhèn)溆?。接種物取自青海知源特色農業(yè)有限責任公司以牛糞為原料發(fā)酵穩(wěn)定的農用沼氣池。發(fā)酵原料和接種物的特性見表1。

表1 原料與接種物特性Table 1 Characteristics of raw materials and inoculum

1.2 試驗方法

1.2.1 青稞秸稈NaOH預處理 試驗設置4種不同NaOH水平(1%、3%、5%和7%)和3個處理時間(6、12、24 h)。將不同水平梯度的NaOH溶液分別添加到青稞秸稈中(控制物料含水率為70%左右), 充分攪拌混勻后放入廣口瓶內, 密封并置于室溫下處理。處理完成后用去離子水沖洗至中性, 60℃烘干備用。同時采用未經任何處理的青稞秸稈作為對照（CK）。

1.2.2 批式厭氧消化試驗 厭氧發(fā)酵試驗采用碧普華瑞環(huán)境技術(北京)有限公司的全自動甲烷潛力測試儀MultiTalent 203。每個發(fā)酵瓶內按設計好的比例(2∶1)分別加入青稞秸稈和接種物, 并設置只添加接種物污泥的空白對照, 各處理組總量為400 g。每組設置3個重復。全部添加后, 將發(fā)酵瓶密封并置于恒溫(35±0.5)℃水浴鍋中。每間隔3 min攪拌1次, 每次攪拌時長為0.5 min。從發(fā)酵24 h開始, 每4 d采集1次發(fā)酵液樣品用以測定pH、氨氮、揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids, VFAs)和化學需氧量(chemical oxygen demand, COD)。

1.3 測定項目及方法

總固體(total solid, TS)和揮發(fā)性固體(volatile solid, VS)采用烘干法測定, 其中, 總固體于烘箱105℃烘24 h, 揮發(fā)性固體于馬弗爐550℃灼燒3 h；pH用pH計(pHS-2F型)測定；氨氮采用苯酚次氯酸鈉比色法測定[15]；揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)采用分光光度法測定[16]；化學需氧量(chemical oxygen demand,COD)采用快速消解分光光度法測定[17]；木質纖維素含量由纖維洗滌劑法測定[18]；傅里葉紅外光譜(frustrated total internal reflection,FTIR)采用固體溴化鉀壓片法進行分析[19]。

1.4 動力學分析

采用修正的Gompertz動力學模型對不同預處理青稞秸稈發(fā)酵過程的甲烷產量進行數據擬合[16]。

式中,P為累積甲烷產量(mL·g-1)；Pmax為產甲烷潛力(mL·g-1)；Rmax為最大產甲烷速率(mL·g-1·d-1)；t為發(fā)酵時間(d)；λ為產甲烷延滯期(d)；e是常數, exp(1)=2.718 3。

1.5 數據分析

采用SPSS軟件分析數據, 采用鄧肯多重比較法, 當P＜0.05時, 數據之間具有顯著性差異；使用Origin 2018制圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對青稞秸稈厭氧發(fā)酵特性的影響

2.1.1 日產甲烷量與累積甲烷產量 不同處理組日產甲烷量變化如圖1所示。在35 d厭氧發(fā)酵過程中, 不同處理組的日產甲烷量均呈現先升高后降低的趨勢, 并出現1~2個產甲烷高峰, 均集中在前7 d。其中, 3% NaOH-24 h處理組日產甲烷量最大, 達到了143.73 mL·d-1；其次是1% NaOH-24 h處理組, 為130.53 mL·d-1。同時, 發(fā)酵前期CK產氣緩慢, 日產甲烷量低于所有NaOH處理組, 說明NaOH預處理能夠加快厭氧發(fā)酵的啟動速率。

圖1 不同處理組的日產甲烷量Fig.1 Daily methane production in different treatments

由圖2可知, 與CK相比, 各NaOH處理組累積甲烷產量均顯著增加(P＜0.05), 說明NaOH預處理可以提高青稞秸稈厭氧發(fā)酵的產甲烷能力。同一時間段內, 各處理組的累積甲烷產量均隨著NaOH水平的增大呈現先升高后降低的趨勢, 5%NaOH處理組高于其他3個NaOH處理組。相同NaOH水平下, 青稞秸稈預處理12 h的累積甲烷產量均高于預處理時間為6和24 h的累積甲烷產量。其中, 5%NaOH-12 h處理組獲得了最高累積甲烷產量, 達到250.03 mL·g-1, 較CK顯著提高了67.92%；其次是5%NaOH-24 h和5%NaOH-6 h組, 累積甲烷產量分別為242.13和240.85 mL·g-1, 分別較CK顯著提高了62.61%和61.75%。T90表示物料累積甲烷產量達到總甲烷產量90%時需要的時間。由表2可知, CK的T90為22 d, 各NaOH處理組的T90均在13~17 d之間, 說明NaOH預處理能夠縮短青稞秸稈的發(fā)酵周期, 提高發(fā)酵效率。

圖2 不同處理組的累積甲烷產量Fig.2 Cumulative methane production in different treatments

2.1.2動力學分析 不同處理組累積甲烷產量的Gompertz方程擬合曲線和擬合結果如表2所示。R2可以衡量動力學方程的擬合度, 當R2大于0.990時, 擬合結果較好。由表2可知, 各處理組的R2均大于0.990, 說明擬合效果較好, 并且NaOH預處理組的產甲烷潛力和最大產甲烷速率均大于CK, 說明NaOH預處理能夠提高青稞秸稈的產甲烷潛力和速率。所有NaOH預處理組的產甲烷延滯期均小于CK, 說明NaOH預處理可以加快發(fā)酵的啟動。

表2 不同處理組的消化時間T90及Gompertz模型的動力學參數Table 2 Digestion time T90 and kinetic parameters of Gompertz model in different treatments

2.2 不同處理發(fā)酵液pH、氨氮、揮發(fā)性脂肪酸和化學需氧量的變化

由 圖3可 知, CK的pH在7.58~7.78之 間, NaOH處理組的pH在7.17~8.01之間, 均屬于產甲烷菌正常生長的范圍。相比CK, NaOH處理組pH變化波動更大, 這表明NaOH處理組的有機酸產生和消耗更快。整體而言, 1~5 d內, 各處理組的pH明顯下降, 均在第5天出現最低值, 說明發(fā)酵系統(tǒng)正處于水解酸化的啟動階段, 有機酸大量產生；第5天后, pH又迅速上升并逐漸趨于穩(wěn)定, 表明產甲烷菌開始活躍, 大量消耗發(fā)酵前期的酸性物質產生甲烷。

圖3 不同處理組pH變化Fig.3 Changes of pH value in different treatments

由圖4可知, CK的氨氮含量在714.27~877.40 mg·L-1范圍內, NaOH處理組的氨氮含量在717.33~972.80 mg·L-1范圍內, 高于CK處理組。說明NaOH處理組的有機物分解更快, 但各處理組的氨氮含量均未超過1 000 mg·L-1, 未對體系造成氨抑制。同一時間段內, 水平較低(1%、3%)的NaOH處理組氨氮含量峰值高于水平較高(5%、7%)的NaOH處理組, 但各處理組的氨氮含量整體變化趨勢相差不大, 均呈現先上升再降低后趨于平穩(wěn)的趨勢, 且峰值均出現在13 d之前, 說明該時期微生物對底物的降解最快。

圖4 不同處理組的氨氮含量變化Fig.4 Changes of ammonia nitrogen concentration in different treatments

由圖5可知, CK的VFAs含量 在1 781.15~3 075.84 mg·L-1范圍內, NaOH處理組的VFAs含量在1 102.77~4 973.54 mg·L-1范圍內, 均沒有對體系產生抑制作用。其中, 預處理時間長的NaOH處理組(12、24 h)VFAs含量峰值高于預處理時間短的NaOH處理組(6 h), 說明預處理時間長的處理組在發(fā)酵前期能產生更多的有機酸。但在整個發(fā)酵周期中, 所有處理組的VFAs含量變化趨勢卻無明顯區(qū)別, 均在發(fā)酵第5天達到最大值后逐漸降低并趨于穩(wěn)定。這說明發(fā)酵前期主要是產酸階段, 發(fā)酵后期則表現為有機酸的產生和消耗達到平衡。

圖5 不同處理組的揮發(fā)性脂肪酸含量變化Fig.5 Changes of VFAs concentration in different treatments

不同處理組發(fā)酵過程中COD的變化情況如圖6所示。隨著反應的進行, 各處理組的COD均整體呈現先升高再降低后趨于穩(wěn)定的趨勢, 與氨氮含量和VFAs含量變化趨勢相似。此外, 各處理組的COD峰值均集中在5~9 d。結合圖2可知, 累積甲烷產量較高的處理組COD峰值也相對較高, 同一時間段內, 3%、5% NaOH處理組的累積甲烷產量要高于其他處理組, 而COD峰值也相對較高；其中, 5% NaOH-12 h處理組最高, 為9 695.42 mg·L-1, 該處理組累積甲烷產量也最高, 為250.03 mL·g-1。

圖6 不同處理組的化學需氧量變化Fig.6 Changes of COD in different treatments

2.3 不同處理青稞秸稈傅里葉紅外光譜圖分析

為更好地了解預處理前后青稞秸稈木質纖維素組分的變化情況, 對各處理組進行傅里葉紅外光譜圖(FTIR）分析。由圖7可知, 預處理前后的紅外光譜圖形狀大致相同, 說明NaOH預處理并未改變青稞秸稈的官能團及化學鍵種類, 而是改變了其木質纖維素的內部結構, 表現在某些峰吸收強度的不同。表3呈現了紅外光譜中不同波長對應的基團種類及青稞秸稈木質纖維組分變化情況, 波數3 330 cm-1附近強而寬的吸收峰主要來自羥基(O-H)的拉伸振動, 是木質素吸收光譜峰[20]。相比CK, 各處理該吸收峰強度明顯降低, 說明NaOH預處理可降解青稞秸稈中的木質素, 導致秸稈基質孔隙度增加。波數2 854和2 910 cm-1附近較強而尖銳的吸收峰是由于C-H中甲基和亞甲基對稱和反對稱拉伸振動引起的, 該峰代表纖維素的吸收強度[21]。各預處理后該吸收峰相比CK明顯增強, 說明NaOH預處理增加了纖維素含量。在1 621 cm-1附近出現的是羰基鍵和苯環(huán)的吸收峰, 該峰代表半纖維素和木質素的吸收強度。處理后峰強度減弱, 表明青稞秸稈中半纖維素和木質素得到有效去除[22]。

圖7 不同處理組青稞秸稈的紅外光譜Fig.7 Infrared spectra of hulless barley straw treated in different treatments

表3 不同波長對應的基團種類及纖維組分變化情況Table 3 Changes of group types and fiber components corresponding to different wavelengths

2.4 不同處理青稞秸稈組分含量變化

不同處理組青稞秸稈中的木質纖維素變化情況如表4所示。與CK相比, 大多數NaOH處理組的木質素和半纖維素含量均顯著降低(P＜0.05), 二者降解率分別為12.83%~64.34%和0.96%~30.30%, 木質素降解率高于半纖維素。同一時間段內, 7%NaOH處理后的木質素降解率均高于其他處理組。其中, 7%NaOH-6 h的木質素降解率最高, 達到64.34%, 但7% NaOH各處理的累積甲烷產量卻低于5%NaOH各處理(圖2), 說明過高的堿含量會影響體系的產甲烷能力。與木質素和半纖維素被降解結果不同, 各NaOH處理組的纖維素含量均顯著提高(P＜0.05), 相比CK提高了13.37%~39.31%。綜上, NaOH預處理增加了青稞秸稈中纖維素含量, 并有效降解了木質素和半纖維素, 其中對木質素的降解效果更好。表明NaOH預處理可以在一定程度上提高青稞秸稈的生物降解率。

表4 不同處理組青稞秸稈木質纖維素含量Table 4 Lignocellulose content of hulless barley straw in different treatments （%）

3 討論

NaOH是一種常見且價格低廉的化學預處理試劑, 能夠提升玉米[9]、稻草[8]、黑麥[11]、蘆葦[23]、甘蔗葉[6]和玫瑰莖稈[10]等多種木質纖維素類廢棄物的厭氧發(fā)酵效率。本研究中, NaOH預處理對青稞秸稈厭氧發(fā)酵也發(fā)揮了較好的作用, 顯著提高了其產甲烷性能(P＜0.05)。相比CK, 各NaOH處理組的累積甲烷產量提高了14.59%~67.92%, 其中5% NaOH處理12 h獲得了最高累積甲烷產量, 為250.03 mL·g-1。有研究表明, 蘆葦經過不同含量NaOH預處理后的最高累積甲烷產量為237 mL·g-1[23]；麥糠經過6% NaOH處理獲得的最大產甲烷潛力為199.5 mL·g-1[24]；玫瑰莖稈經過NaOH預處理后的累積甲烷產量在81.8~117.7 mL·g-1[10]。說明青稞秸稈的發(fā)酵潛力高于多數木質纖維素類廢棄物, 是良好的發(fā)酵原料。同時, 各NaOH處理組達到T90的時間相比CK均縮短, 并且對于表示產氣延滯期的λ值, 各NaOH處理組也均小于CK。說明NaOH能夠縮短青稞秸稈厭氧發(fā)酵周期, 加快發(fā)酵系統(tǒng)的啟動。已有研究也能夠證實NaOH的這一作用, 李桃等[25]研究表明NaOH預處理能夠縮短廢棄香蕉秸稈厭氧發(fā)酵的啟動時間；羅娟等[6]和Ivo等[23]發(fā)現NaOH預處理能夠將甘蔗葉和蘆葦的T90分別縮短3~5和13 d。

本研究發(fā)現, NaOH預處理能夠有效降解青稞秸稈木質素和半纖維素, 尤其是對木質素的降解效果較好, 這與前人的研究結果一致[6,9,13,26]?？赡苁且驗镹aOH堿性較強, 能夠迅速破壞木質素與多糖之間的化學鍵, 促使木質素結構斷裂, 從而達到降解的目的[20]。同時, NaOH預處理增加了青稞秸稈中纖維素含量, 由于堿預處理能夠引起木質纖維素聚合物發(fā)生解聚, 使得更多被木質素和半纖維素包裹的纖維素暴露, 從而造成纖維素含量增加[27-28]。

研究還發(fā)現, NaOH預處理能夠維持發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性。通常來講, pH、氨氮和VFAs均是衡量發(fā)酵系統(tǒng)是否穩(wěn)定的指標。pH在6.8~7.8之間最適合發(fā)酵, 過高(＞8.5)或過低(＜6.4)均會抑制發(fā)酵微生物活性[29]；適量的氨氮可以為發(fā)酵體系提供氮源, 緩解酸抑制現象, 含量過高則會抑制產甲烷菌的生長, 影響發(fā)酵效果[15,30]；VFAs可以被產甲烷菌利用產生甲烷, 但VFAs累積過多(＞5 000 mg·L-1)會造成系統(tǒng)酸化[7,31]。本研究中, 所有NaOH處理組的pH、氨氮和VFAs含量值均保持在發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定范圍內, 沒有產生抑制現象。此外, COD主要包括水解產生的有機物質和未能被利用的VFAs等。一般來說, COD水平越高越有利于微生物的生存和繁殖[17,32], 本研究中COD水平高的處理組對應的累積甲烷產量也較高, 符合上述規(guī)律。綜上所述, 適宜水平的NaOH預處理不僅能夠增加青稞秸稈的甲烷產率、縮短發(fā)酵周期、維持發(fā)酵的穩(wěn)定性, 還能夠節(jié)約預處理試劑的成本, 是青稞秸稈等木質纖維素類廢棄物厭氧發(fā)酵的有效預處理手段。