張艷艷，董學(xué)彩，高玉霞，王文翔

子宮內(nèi)膜癌作為女性絕經(jīng)期高發(fā)的生殖道惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。隨著現(xiàn)有的診療水平不斷提高，該腫瘤早期診斷率、生存率及生存期不斷改善[2]，但其具體發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚，特別是晚期患者，治療效果仍不佳且預(yù)后差[3]。因此，有必要進(jìn)一步從分子水平明確子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制，尋找敏感基因以指導(dǎo)該腫瘤的早期診療。X染色體耦聯(lián)鋅指蛋白(zinc finger protein X-linked, ZFX)作為鋅指蛋白超家族成員，參與調(diào)控了基因表達(dá)、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等過程[4]，并且在多種惡性腫瘤組織中出現(xiàn)異常表達(dá)[5]，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移中發(fā)揮重要作用[6]。然而，其是否參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病鮮有報道。本實驗采用免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜癌組織中ZFX蛋白表達(dá)，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，利用小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)技術(shù)抑制人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中ZFX mRNA的表達(dá)，觀察其對增殖和侵襲的影響，以期為子宮內(nèi)膜癌機(jī)制研究及早期診療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選取2019年1月～2020年12月新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院診治的98例子宮內(nèi)膜癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)初次接受手術(shù)治療，術(shù)后行病理學(xué)檢查均為子宮內(nèi)膜樣腺癌；(2)術(shù)前均未行任何放、化療；(3)臨床資料完整。排除繼發(fā)性腫瘤、其他系統(tǒng)惡性腫瘤者，以及急慢性炎癥、嚴(yán)重肝腎功能障礙者。98例患者年齡28～75歲，平均(54.72±9.01)歲，根據(jù)2018年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期52例，Ⅱ期25例，Ⅲ期21例；病理分級：G1 42例，G2 44例，G3 12例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例。同期，選取46例因子宮肌瘤行手術(shù)切除的正常子宮內(nèi)膜組織作為對照，年齡26～74歲，平均(53.60±10.05)歲，兩組患者年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本實驗經(jīng)新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑和設(shè)備免疫組化SP法試劑盒和配套試劑購自武漢博士德公司，兔抗人ZFX多克隆抗體購自美國Abcam公司，DAB和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋公司，子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞系購自上海谷研生物公司，胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自日本Takara公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)液購自上海碧云天生物公司，二甲基亞砜(DMSO)購自上海徠儀生物公司，Transwell小室及基質(zhì)膠購自美國Corning公司，iQ5實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 石蠟組織標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，經(jīng)烤片、脫臘、梯度乙醇水化，浸入檸檬酸鈉液中行微波抗原修復(fù)。將一抗兔抗人ZFX多克隆抗體按1 ∶600稀釋后滴加，4 ℃過夜孵育，PBS沖洗3次，滴加二抗，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、封固，鏡下觀察。以PBS替代一抗作陰性對照。ZFX蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，采用半定量法[7]進(jìn)行評分：(1)按陽性細(xì)胞百分比評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；(2)按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分：不著色為0分、淡黃色為1分、黃褐色為2分、棕褐色為3分；將兩項得分結(jié)果相乘：<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)Ishikawa細(xì)胞，條件：5%CO2、37 ℃。待細(xì)胞融合度達(dá)80%時，胰酶消化、傳代培養(yǎng)。用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒對對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染：(1)si-ZFX組：轉(zhuǎn)染ZFX的siRNA序列：5′-UGAAAUCGCUGACGAAUGG-3′；5′-ACACAGAGUCGGAAAUUGA-3′；(2)si-對照組：轉(zhuǎn)染陰性對照序列：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′；(3)空白組：不作任何處理。各組處理后培養(yǎng)48 h。

1.3.3qRT-PCR 取各組轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解，用Trizol試劑提取總RNA，使用紫外分光光度計對其純度和濃度檢測。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用實時熒光定量PCR儀按PCR試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，ZFX引物序列：上游5′-TATGGATTCACTCGTCAA-3′，下游5′-CTCAGATGTAACAGAAGAAG-3′；β-actin引物序列：上游5′-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3′，下游5′-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，合計38個循環(huán)。用2-ΔΔCt法計算細(xì)胞中ZFX mRNA的相對表達(dá)量。

1.3.4MTT法 取轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長細(xì)胞，胰酶消化，離心后制備單細(xì)胞懸液，密度為每毫升2.5×104個細(xì)胞，按每孔200 μL接種于96孔板，繼續(xù)在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分布于12、24、48、72和96 h時，往各孔加入MTT液20 μL，培養(yǎng)4 h，停止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，振蕩15 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各孔吸光度A值。重復(fù)實驗3次。

1.3.5Transwell實驗 取轉(zhuǎn)染后對數(shù)生長細(xì)胞，胰酶消化，離心后用無血清培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液，密度為每毫升2.5×105個細(xì)胞。將細(xì)胞懸液200 μL接種于Transwell小室上室，下室則加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，結(jié)晶紫染色，并用棉簽將上室內(nèi)散落細(xì)胞拭去，鏡下觀察，隨機(jī)取5個高倍視野計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞遷移能力，重復(fù)實驗3次。在檢測細(xì)胞侵襲力時，則提前24 h用培養(yǎng)液對基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋后，平鋪于小室上室，過夜風(fēng)干備用，其余步驟同遷移實驗。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織中ZFX蛋白表達(dá)子宮內(nèi)膜癌組織中ZFX蛋白陽性率為74.49%(73/98)，高于正常子宮內(nèi)膜組織(23.91%，11/46)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=32.947，P<0.001，圖1)。

AB

2.2 ZFX蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系ZFX蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者年齡、腫瘤直徑、浸潤深度無關(guān)(P>0.05)，與病理分級、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05，表1)。

表1 ZFX蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 子宮內(nèi)膜癌三組細(xì)胞中ZFX mRNA表達(dá)si-ZFX組、si-對照組和空白組細(xì)胞中ZFX mRNA相對表達(dá)量分別為0.26±0.07、1.01±0.09和1.03±0.10，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=136.233，P<0.001)，si-對照組和空白組細(xì)胞中ZFX mRNA相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.176)，si-ZFX組細(xì)胞中ZFX mRNA相對表達(dá)量低于si-對照組和空白組(P<0.05)。

2.4 子宮內(nèi)膜癌三組細(xì)胞的增殖活性si-ZFX組24、48、72和96 h時細(xì)胞吸光度A值均低于si-對照組和空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 三組細(xì)胞不同時間點(diǎn)吸光度A值比較

2.5 子宮內(nèi)膜癌三組細(xì)胞遷移和侵襲能力si-ZFX組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于si-對照組和空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3，圖2)。

表3 三組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較個)

si-ZFX組si-對照組空白組遷移侵襲

3 討論

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，由于早期癥狀不典型，多數(shù)患者就診時已處于中晚期，錯失最佳治療時機(jī)[8]。目前，手術(shù)輔以放、化療仍是患者主要治療手段[9]，但術(shù)后高復(fù)發(fā)率和高病死率一直是臨床醫(yī)師亟待解決的問題。因此，積極從分子水平探討與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)敏感基因，實現(xiàn)對患者早期診療，對改善患者預(yù)后意義重大。ZFX作為鋅指蛋白超家族成員之一，廣泛存在于真核生物體內(nèi)并參與調(diào)控眾多生物學(xué)功能，與胚胎發(fā)育及干細(xì)胞自我更新密切相關(guān)[10]。近年研究發(fā)現(xiàn)[11]，其可充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子而參與多種人類腫瘤的發(fā)生。有研究指出[12]，ZFX異常表達(dá)與胰腺癌發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，可作為判斷患者預(yù)后的指標(biāo)。崔紀(jì)芳等[13]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中ZFX基因和蛋白水平均異常升高，并與患者臨床病理特征相關(guān)。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)ZFX促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及化療耐藥。亦有研究[15]發(fā)現(xiàn)沉默ZFX可阻礙非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展。本實驗結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中ZFX蛋白陽性率高于正常子宮內(nèi)膜組織，說明ZFX蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，可能在促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本實驗結(jié)果顯示，病理分級G2～G3、FIGO分期Ⅱ～Ⅲ期和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌組織中ZFX蛋白陽性率升高，說明ZFX蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌惡性化指標(biāo)有關(guān)，可能參與了子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展。

為進(jìn)一步觀察ZFX在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，本實驗利用siRNA技術(shù)特異性抑制Ishikawa細(xì)胞中ZFX基因表達(dá)，結(jié)果顯示，si-ZFX組細(xì)胞中ZFX mRNA相對表達(dá)量低于si-對照組和空白組，說明Ishikawa細(xì)胞中ZFX基因表達(dá)被成功抑制。有研究指出[16]，ZFX通過MAPK途徑促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖。亦有研究指出[17]，靶向沉默ZFX表達(dá)可抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞克隆、增殖。本實驗結(jié)果顯示，si-ZFX組24、48、72和96 h時細(xì)胞吸光度A值均低于si-對照組和空白組，說明抑制Ishikawa細(xì)胞中ZFX基因表達(dá)可明顯降低細(xì)胞增殖活性，提示ZFX可能與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。多項研究表明[18-20]，ZFX參與調(diào)控了惡性腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過程。本實驗結(jié)果顯示，si-ZFX組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均低于si-對照組和空白組，說明抑制Ishikawa細(xì)胞中ZFX基因表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞遷移和侵襲力，提示ZFX可能參與了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲過程。

綜上所述，ZFX蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，與病理分級、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，抑制Ishikawa細(xì)胞中ZFX基因表達(dá)可降低細(xì)胞增殖活性，抑制細(xì)胞遷移和侵襲力，有望為子宮內(nèi)膜癌機(jī)制研究及早期診療提供新的靶位。