張京城，徐 凱，王 成

胰腺癌惡性程度高、預(yù)后差，手術(shù)是根治胰腺癌的唯一辦法，但大多數(shù)患者因早期癥狀不典型、診斷滯后等原因而錯失最佳手術(shù)治療時機；以吉西他濱為代表的化療方案，雖能延長晚期患者的中位生存期，但患者5年生存率仍低于9%[1]。因此，尋找胰腺癌可靠的生物學(xué)標志物和有效的治療靶點，進一步探索分子調(diào)控機制，一直是胰腺癌領(lǐng)域的研究前沿。aGPCRs作為第二大類G蛋白偶聯(lián)受體家族，近來被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌[2]、肺癌[3]、前列腺癌[4]等腫瘤中異常表達，其中一些受體與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，但其在胰腺癌中的研究卻少有報道[5]。本實驗結(jié)合生物信息學(xué)分析與臨床樣本免疫組化染色，探討aGPCRs在胰腺癌中的表達及其臨床意義，挖掘潛在的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析利用Oncomine(www.oncomine.org)、GEPIA2(http://gepia2.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫尋找胰腺癌與正常胰腺組織之間在轉(zhuǎn)錄組水平廣泛差異表達的aGPCRs；利用K-M plotter(http://kmplot.com/)數(shù)據(jù)庫，通過選擇“Auto select best cutoff”和“OS”，獲得aGPCRs轉(zhuǎn)錄組表達水平與生存期之間Log-rank檢驗的P值、風(fēng)險比和95%置信區(qū)間，分析差異表達aGPCRs轉(zhuǎn)錄組水平與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.2 臨床資料收集2016～2018年安徽省立醫(yī)院存檔的胰腺癌組織及其癌旁組織各58例，胰腺癌組織術(shù)后病理檢查均證實為胰腺導(dǎo)管腺癌，患者術(shù)前均未行放、化療，經(jīng)術(shù)后隨訪獲取患者預(yù)后情況?；颊吣挲g41～80歲，平均(63.09±9.232)歲，其中男性37例，女性21例；腫瘤直徑>4 cm者20例，≤4 cm者38例；根據(jù)2018年美國AJCC臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期36例，Ⅲ+Ⅳ期22例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者26例；根據(jù)國際UICC組織分級：低分化30例，高+中等分化28例；有神經(jīng)浸潤41例，無神經(jīng)浸潤17例。

1.3 免疫組化利用臨床胰腺癌及其癌旁組織中mRNA水平廣泛差異表達且與患者預(yù)后相關(guān)的aGPCRs蛋白水平表達情況，采用免疫組化SP兩步法進行染色，抗原修復(fù)采用高壓蒸汽法，兔抗人ADGRA2、ADGRC3、ADGRF1、ADGRG6、ADGRE5、ADGRF4多克隆抗體購自博奧森生物公司，DAB顯色試劑盒及通用SP試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。以HPA(https://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫明確為陽性的標本作為陽性對照組，以PBS緩沖液作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷染色結(jié)果由兩位病理醫(yī)師獨立評估。隨機選取5個高倍鏡視野，根據(jù)陽性細胞的百分比進行評分：≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%以上為3分；另根據(jù)陽性細胞著色強度進行評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終將兩項評分相乘，其中≥6分歸為高表達組，<6分為低表達組。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗分析蛋白表達與臨床病理特征的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier生存曲線及Log-rank檢驗分析目的蛋白表達與預(yù)后的相關(guān)性；采用Cox回歸模型進行單因素和多因素生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌中aGPCRs mRNA的表達Oncomine、GEPIA2數(shù)據(jù)庫檢測發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中11個aGPCRs(ADGRE5、ADGRA2、ADGRC3、ADGRF1、ADGRF4、ADGRG1、ADGRG6、ADGRL4、ADGRF5、ADGRL2、ADGRE2)的mRNA廣泛高表達(P<0.05)。K-M plotter數(shù)據(jù)庫檢測發(fā)現(xiàn)，ADGRE5、ADGRF1、ADGRF4、ADGRG6 mRNA表達與患者預(yù)后呈負相關(guān)，ADGRA2、ADGRC3 mRNA表達與患者預(yù)后呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)果提示ADGRE5、ADGRA2、ADGRC3、ADGRF1、ADGRF4、ADGRG6可作為胰腺癌預(yù)后的生物學(xué)標志物，可能是胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的潛在因子(圖1)。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(A)、GEPIA2數(shù)據(jù)庫(B)中aGPCRs mRNA表達水平及其與患者預(yù)后的相關(guān)性(C)：N.癌組織；T.正常組織

2.2 胰腺癌組織中ADGRF4、ADGRE5、ADGRC3蛋白表達免疫組化結(jié)果顯示，ADGRA2、ADGRF1在癌旁組織中的表達水平高于胰腺癌組織，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；ADGRG6在癌旁組織及胰腺癌組織中均未見明顯表達；ADGRF4、ADGRE5、ADGRC3在胰腺癌組織中表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。ADGRF4表達定位于細胞膜和細胞質(zhì)，部分病例可見胞核強陽性，陽性率為84%(49/58)；ADGRE5表達定位于細胞質(zhì)和細胞膜，陽性率達95%(55/58)；ADGRC3表達主要定位于細胞質(zhì)，陽性率為52%(30/58)。

ADGRF4ADGRE5ADGRC3ADGRA2ADGRF1ADGRG6癌旁癌

2.3 ADGRF4、ADGRE5表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計分析顯示，ADGRC3表達與胰腺癌各項臨床病理特征均不相關(guān)；ADGRF4表達與患者年齡、性別、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度無關(guān)，與腫瘤直徑、神經(jīng)浸潤呈正相關(guān)(P<0.05)；ADGRE5表達與患者年齡、性別、腫瘤分化程度、神經(jīng)浸潤無關(guān)，與臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05，表1)。

表1 ADGRF4、ADGRE5表達與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4 ADGRF4、ADGRE5蛋白表達與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，ADGRF4、ADGRE5蛋白表達水平與患者預(yù)后呈負相關(guān)(P<0.01，圖3)。Cox單因素回歸分析顯示，TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ADGRF4表達、ADGRE5表達，均是胰腺癌患者預(yù)后的影響因素(P<0.05，表2)，Cox多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期、腫瘤直徑、ADGRF4表達是胰腺癌患者預(yù)后的獨立影響因素(P<0.05，表2)。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析ADGRF4(A)、ADGRE5(B)與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性

表2 Cox單因素及多因素分析胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)因素

3 討論

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，在我國其發(fā)病率呈逐年升高趨勢，病死率位居惡性腫瘤的第7位[6]。GPCRs是最大的跨膜蛋白超家族，由于其結(jié)構(gòu)的特殊性和功能的多樣化，全球約34%的靶向藥物針對GPCRs[7-8]，其在腫瘤中的研究具有巨大的潛在價值。aGPCRs因具有一個大的細胞外黏附結(jié)構(gòu)域和七次跨膜結(jié)構(gòu)域被命名，表現(xiàn)為細胞黏附功能和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[9]。也因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，aGPCRs相關(guān)研究一直較少，半數(shù)以上受體仍為孤兒受體，未能找到特異性配體[10]。近年，aGPCRs參與惡性腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和腫瘤細胞間通訊的功能逐漸被發(fā)現(xiàn)[11-12]。

ADGRF4是ADGRF亞家族成員之一，又被命名為GPR115、PGR18。目前，關(guān)于ADGRF4的研究十分有限。2020年Chiba等[13]發(fā)現(xiàn)ADGRF4通過調(diào)控成釉細胞中CAR6的表達參與牙釉質(zhì)的礦化過程。在腫瘤領(lǐng)域，有研究通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ADGRF4在甲狀腺癌、結(jié)腸癌中表達升高，但并未展開深入的實驗性研究[14-15]。本實驗通過生物信息學(xué)分析結(jié)合免疫組化染色首次探討ADGRF4在胰腺癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)ADGRF4在胰腺癌中高表達，是胰腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素，其表達與腫瘤直徑、神經(jīng)浸潤呈正相關(guān)。神經(jīng)浸潤是指腫瘤細胞侵入神經(jīng)或神經(jīng)周圍。已往多項研究報道[16-17]，胰腺癌的神經(jīng)浸潤率是所有惡性腫瘤中最高的，是胰腺癌的重要特征，也是胰腺癌侵襲性行為和預(yù)后不良的重要指標。ADGRF4是否通過影響神經(jīng)浸潤發(fā)揮促癌作用，是下一步研究的方向。

ADGRE5是ADGRE亞家族成員之一，又被命名為TM7LN1、CD97，廣泛存在于淋巴細胞、單核細胞、粒細胞和平滑肌等細胞的表面[18]。目前關(guān)于ADGRE5在腫瘤中的研究相對較多，被發(fā)現(xiàn)在包括甲狀腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌中異常表達或存在生化修飾，在腫瘤外緣具有強侵襲作用的癌細胞中表達則更為顯著[19]，其表達與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)[20]。實際上，關(guān)于ADGRE5在胰腺癌中的表達早前亦有報道。Boltze等[21]采用免疫組化法檢測50例胰腺癌組織、40例胰腺炎組織、36例正常胰腺組織中ADGRE5的表達，發(fā)現(xiàn)ADGRE5在胰腺炎中表達較強，在低分化胰腺癌中弱表達，而在正常胰腺和中、高分化胰腺癌組織中并不表達。Aust等[22]采用免疫組化法檢測18例胰腺癌組織和流式細胞術(shù)檢測胰腺癌細胞系PANC-1、BXPC3中ADGRE5的表達，發(fā)現(xiàn)兩種細胞系和14例胰腺癌組織中ADGRE5均陽性。本實驗發(fā)現(xiàn)，ADGRE5在胰腺癌中廣泛表達，陽性率高達95%(55/58)，本組樣本量較上述兩項研究稍多，初步解決了ADGRE5在胰腺癌組織中表達的爭議問題。機制方面，ADGRE5在腫瘤中的作用機制多樣，如通過其細胞外結(jié)構(gòu)域與整合素a5b1和avb3相互作用促進血管內(nèi)皮細胞遷移和生成[23]、對BCL-2超家族中抗凋亡和促凋亡成員的調(diào)節(jié)[24]等，本實驗中ADGRE5表達與TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是胰腺癌患者預(yù)后的危險因素之一，ADGRE5可能廣泛參與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展等多個環(huán)節(jié)，其深入機制仍有待于進一步探究。

綜上所述，本實驗以胰腺癌作為研究對象，利用生物信息學(xué)分析系統(tǒng)性初篩、臨床樣本驗證，在mRNA和蛋白水平探討aGPCRs在胰腺癌中的表達模式及其生物學(xué)意義。實驗結(jié)果表明，ADGRE5、ADGRA2、ADGRC3、ADGRF1、ADGRF4、ADGRG6 mRNA在胰腺癌組織中高表達，且與患者預(yù)后相關(guān)，是胰腺癌潛在的預(yù)后生物學(xué)標志物。ADGRF4、ADGRE5在蛋白水平高表達且與胰腺癌臨床病理特征密切相關(guān)，是胰腺癌患者預(yù)后的危險因素，隨著對其結(jié)構(gòu)和功能機制的深入研究，有望成為胰腺癌治療的重要靶點。