鐘燕燕，王進(jìn)京，鐘戀君，羅 帥，鄭 洪

乳腺癌作為全球癌癥死亡的第二大因素，其病死率占所有癌癥死亡原因的11.6%[1]。殘余腫瘤負(fù)荷(residual cancer burden, RCB)指數(shù)考慮了殘留腫瘤床、殘余腫瘤細(xì)胞比例和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等多種情況，可對(duì)乳腺癌患者術(shù)后進(jìn)行殘余疾病評(píng)估[2]。鑒于新輔助化療后仍有較多乳腺癌患者不能達(dá)到病理完全緩解(pathological complete response, PCR)(PCR指乳腺癌原發(fā)灶及腋窩淋巴結(jié)手術(shù)標(biāo)本病理檢查均未見浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞殘余)，采用RCB系統(tǒng)分層評(píng)估成為病理精準(zhǔn)診斷的重要內(nèi)容[3]。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)是有效且持續(xù)的抗腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵性基礎(chǔ)，腫瘤周圍微環(huán)境中的TILs也被認(rèn)為在腫瘤免疫機(jī)制中起著免疫應(yīng)答和調(diào)控作用[4-5]。RCB系統(tǒng)只考慮了殘余疾病情況，并未對(duì)宿主免疫應(yīng)答情況進(jìn)行考察，這有可能會(huì)對(duì)預(yù)后分析的準(zhǔn)確性造成一定程度的偏差，而RCB與TILs的結(jié)合將會(huì)為我們帶來更多有效的預(yù)后信息。本實(shí)驗(yàn)將RCB和TILs結(jié)合，定義為“RCB-TILs”指標(biāo)，分析驗(yàn)證該指標(biāo)與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為預(yù)測(cè)臨床療效提供新思路。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2019年10月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科存檔的空心針穿刺病理活檢診斷為浸潤(rùn)性乳腺癌，并接受新輔助化療后行手術(shù)切除的乳腺癌患者106例，所有病例均經(jīng)兩位以上有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)專家確診。收集其臨床和病理資料，包括患者年齡、組織學(xué)特征、免疫表型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及存活時(shí)間等，存檔蠟塊組織健全。

1.2 乳腺癌分子分型根據(jù)ER、PR、HER-2和Ki-67的免疫表型，將乳腺癌分為4個(gè)亞型：管腔A型(ER/PR陽性，且PR陽性率≥20%，HER-2陰性且Ki-67增殖指數(shù)<20%)、管腔B型(ER/PR陽性，HER2陰性，Ki-67增殖指數(shù)≥20%或PR陽性率<20%；ER/PR陽性，HER-2陽性及Ki-67增殖指數(shù)任何表達(dá)水平)、HER2過表達(dá)型(ER/PR陰性，HER-2陽性)和三陰型(ER、PR及HER-2均陰性)。本實(shí)驗(yàn)將管腔A型和管腔B型歸為激素受體陽性乳腺癌(hormone receptor positive breast cancer, HRBC)。ER、PR、HER-2和Ki-67免疫組化結(jié)果判讀及分子分型參照最新對(duì)應(yīng)指南進(jìn)行[6-8]。

1.3 RCB的組織病理學(xué)評(píng)估RCB由MD Anderson腫瘤中心提出，根據(jù)原發(fā)腫瘤(原發(fā)腫瘤床面積、腫瘤細(xì)胞占瘤床百分比和原位癌百分比)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(陽性淋巴結(jié)數(shù)量和最大轉(zhuǎn)移直徑)的數(shù)據(jù)自動(dòng)計(jì)算RCB[9]。RCB計(jì)算公式為：RCB=1.4(浸潤(rùn)癌所占比例×原發(fā)灶腫瘤直徑)0.17+[4(1-0.75轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目)×淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最大徑]0.17。根據(jù)計(jì)算結(jié)果將RCB分為三類：微小殘留疾病(RCB-Ⅰ)、中度殘留疾病(RCB-Ⅱ)或廣泛殘留疾病(RCB-Ⅲ)。由于RCB-Ⅰ被認(rèn)為比RCB-Ⅱ和RCB-Ⅲ具有更好的預(yù)后，因此將RCB-Ⅰ歸為陽性，RBC-Ⅱ和RCB-Ⅲ歸為陰性。

1.4 TILs的組織病理學(xué)評(píng)估根據(jù)乳腺癌免疫腫瘤學(xué)生物標(biāo)志物工作組的報(bào)告[10]，在術(shù)前經(jīng)空心針穿刺病理標(biāo)本的HE染色切片上評(píng)估腫瘤基質(zhì)TILs。以所研究視野的比例表示，在400倍放大倍數(shù)下評(píng)估單核炎性細(xì)胞占腫瘤基質(zhì)面積的百分比，原位癌和擠壓偽影等區(qū)域不包括在內(nèi)。浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞巢周圍單核炎性細(xì)胞浸潤(rùn)與基質(zhì)面積比例分別按>50%、10%～50%和≤10%進(jìn)行分類。>50%、10%～50%歸為TILs陽性，≤10%歸為陰性。

1.5 RCB-TILs評(píng)估RCB和TILs評(píng)估相結(jié)合，創(chuàng)建了“RCB-TILs”。RCB陽性且TILs陽性的患者被視為RCB-TILs陽性，任意RCB和(或)TILs陰性均被視為RCB-TILs陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，應(yīng)用Pearson Chi-Square檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行分類變量相關(guān)性分析。采用Kaplan-Meier法評(píng)估無瘤生存期(disease free survival, DFS)，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素生存分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征乳腺癌新輔助化療前空心針穿刺及配對(duì)的新輔助化療后手術(shù)標(biāo)本TILs的HE染色如圖1所示，合計(jì)106例，均為女性患者。其中HRBC 66例，HER-2過表達(dá)型乳腺癌(HER-2 positive breast cancer, HER2BC) 24例，三陰型乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)16例。平均年齡(47.3±9.4)歲(29～72歲)。在接受新輔助化療的患者中，34例(32.1%)為RCB-TILs陽性，72例(67.9%)為陰性。依據(jù)術(shù)后病理狀態(tài)將乳腺癌患者分為病理完全緩解(pathological complete response, PCR)組和非病理完全緩解(non-pathological complete response, non-PCR)組。其中18例(17.0%)為PCR，88例(83.0%)為non-PCR。

2.2 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系在新輔助化療后的乳腺癌組織中，RCB-TILs陽性與乳腺癌腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯及病理狀態(tài)具有相關(guān)性(P<0.05)。RCB-TILs陽性患者占腫瘤直徑<2 cm組及腫瘤直徑>2 cm組的比例分別為50%(16/32)和24.3%(18/74)，前組是后組的2.06倍，RCB-TILs陽性患者腫瘤直徑<2 cm可能性更大；RCB-TILs陽性患者占無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的比例分別為52.5%(32/61)和4.4%(2/45)，前組是后組的11.9倍，RCB-TILs陽性患者更不易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；RCB-TILs陽性患者占無脈管侵犯組及有脈管侵犯組比例分別為36.7%(33/90)和6.2%(1/16)，前組是后組的5.9倍，RCB-TILs陽性患者更不易發(fā)生脈管侵犯；RCB-TILs陽性患者占PCR組及non-PCR組的比例分別為72.2%(13/18)和23.9%(21/88)，前組是后組的3.02倍，RCB-TILs陽性患者更易獲得PCR。RCB-TILs陽性與患者年齡、Ki-67增殖指數(shù)及組織學(xué)分級(jí)無關(guān)(P>0.05，表1)。

ABC

表1 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.3 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系隨訪106例患者，中位隨訪時(shí)間34個(gè)月(3～75個(gè)月)，其中85例患者存活且未發(fā)生病變復(fù)發(fā)、惡化、轉(zhuǎn)移等，21例無瘤生存。根據(jù)RCB-TILs狀態(tài)進(jìn)行DFS分析，結(jié)果顯示新輔助化療后乳腺癌RCB-TILs陽性患者的DFS長(zhǎng)于RCB-TILs陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049 9，圖2)。

圖2 RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 Cox單因素及多因素生存分析新輔助化療后乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)因素Cox單因素分析顯示，患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯、分子分型、病理狀態(tài)、Ki-67增殖指數(shù)、RCB-TILs狀態(tài)、TILs強(qiáng)度均對(duì)患者DFS無明顯影響(P>0.05)；Cox多因素分析顯示，RCB-TILs陽性是經(jīng)新輔助化療患者的有利因素，結(jié)果表明與RCB-TILs陰性相比，RCB-TILs陽性更有助于延長(zhǎng)患者的DFS(HR=0.068，P=0.003，表2)。

表2 乳腺癌患者預(yù)后的Cox單因素和多因素生存分析

3 討論

乳腺癌的新輔助化療方法已被廣泛接受并應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)一個(gè)精準(zhǔn)有效的指標(biāo)預(yù)測(cè)新輔助化療預(yù)后對(duì)乳腺癌患者臨床后續(xù)診療評(píng)估至關(guān)重要。RCB可以準(zhǔn)確識(shí)別出具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的TNBC及HER2BC患者[11]。RCB分類越高，后續(xù)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及擴(kuò)散的可能性越大，可以為新輔助化療后non-PCR患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)做一系列的連續(xù)性預(yù)測(cè)，成為乳腺癌預(yù)后評(píng)估更加準(zhǔn)確的方式[12-14]。

研究表明，乳腺癌組織中高TILs浸潤(rùn)表現(xiàn)出更好的預(yù)后，并且還可以通過TILs的浸潤(rùn)程度評(píng)估新輔助化療的治療效果[15]。經(jīng)新輔助化療的原發(fā)性TNBC中治療前高TILs與PCR率的增加、更長(zhǎng)的DFS和總生存期(overall survival, OS)具有相關(guān)性[16]。作為預(yù)測(cè)新輔助化療療效指標(biāo)，PCR有助于預(yù)測(cè)TNBC和HER2BC患者預(yù)后，但有研究指出其不作為預(yù)測(cè)HRBC的生存指標(biāo)，同時(shí)，在對(duì)治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)中，TILs也僅能預(yù)測(cè)TNBC和HER2BC對(duì)新輔助化療的反應(yīng)[17]。Laas等[18]研究發(fā)現(xiàn)，將TILs評(píng)估聯(lián)合RCB評(píng)分可有效提高RCB評(píng)估系統(tǒng)的預(yù)測(cè)效能。

本實(shí)驗(yàn)將RCB和TILs結(jié)合，分析RCB-TILs在乳腺癌新輔助化療中的預(yù)后作用及臨床意義。有研究顯示RCB-TILs是新輔助化療后所有浸潤(rùn)型乳腺癌復(fù)發(fā)的重要預(yù)測(cè)因子，可能成為代表新輔助化療療效的有效指標(biāo)，且RCB-TILs陽性TNBC患者占比更多，HRBC患者占比更少，與RCB-TILs陰性患者相比，陽性患者更易獲得PCR[19]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。本實(shí)驗(yàn)Cox多因素分析顯示，RCB-TILs陽性是行新輔助化療患者的有利因素，Kaplan-Meier分析顯示RCB-TILs陽性患者的DFS更長(zhǎng)。Pinard等[20]的研究結(jié)果亦證實(shí)RCB指數(shù)和CD4+TILs的組合有助于改善新輔助化療后TNBC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能力。TNBC殘余疾病中TILs的水平與新輔助化療后乳腺癌患者RFS和OS改善明顯相關(guān)，并且為RCB指數(shù)增加了進(jìn)一步的預(yù)后信息[21]。且RCB-TILs受試者工作特征曲線分析表明，RCB-TILs對(duì)所有乳腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)能力均優(yōu)于TILs和RCB，RCB-TILs陽性有助于延長(zhǎng)所有患者DFS，可能成為新輔助化療后乳腺癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素[19]。除此之外，RCB-TILs陽性患者的腫塊更小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管侵犯更少。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合新輔助化療前TILs浸潤(rùn)情況，RCB-TILs與新輔助化療后乳腺癌腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管侵犯等具有相關(guān)性，其可能成為新輔助化療后乳腺癌DFS的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)臨床后續(xù)的診療及評(píng)估具有指導(dǎo)意義。