陳翔宇，王 弦,2，胡 月,3，吳 強,4

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，也是女性癌癥死亡的主要原因之一[1]?；匀橄侔?metaplastic breast cancer, MBC)是乳腺癌中具有腫瘤性上皮向鱗狀細胞和(或)間葉成分分化特征的腫瘤[2]，其預(yù)后差[3]，至今無可靠的預(yù)后指標(biāo)。研究表明，MBC中富含乳腺癌腫瘤干細胞(breast cancer stem cells, BCSC)，并因此出現(xiàn)上皮向間質(zhì)分化的特征，同時這種特征使MBC更具有侵襲性和化療抗性[4]。既往實驗發(fā)現(xiàn)，SOX9可以調(diào)節(jié)腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSC)，促進癌癥的進展[5]。在乳腺癌中，SOX9對維持BCSC群的功能至關(guān)重要，高表達的SOX9與乳腺癌腫瘤的進展相關(guān)[6]。MBC中富含BCSC，但目前尚無SOX9與BCSC標(biāo)志物相關(guān)性的研究。故本實驗采用免疫組化法檢測MBC中SOX9及BCSC標(biāo)志物的表達，分析其與MBC臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2011～2020年安徽醫(yī)科大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院存檔的42例MBC手術(shù)切除標(biāo)本及患者的臨床資料，患者手術(shù)前均未接受過新輔助化療。所有腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO(2019)MBC組織學(xué)分型。根據(jù)腫瘤成分類型分類：鱗狀細胞癌22例、梭形細胞癌5例、低級別腺鱗癌1例、伴異源性間葉樣分化型7例、含兩種及兩種以上化生成分MBC 7例。此外，42例MBC中同時具有化生型成分和浸潤性乳腺癌非特殊型(invasive breast carcinoma of no special type, IBC-NST)者38例，其中鱗狀細胞癌21例，化生成分占30%～90%；梭形細胞癌5例，化生成分占50%～70%；伴異源性間葉樣分化型7例，化生成分占40%～80%；含兩種及兩種以上化生成分MBC 5例，化生成分占70%～90%。每半年以查詢病例或電話對患者進行隨訪。無進展生存期(progression-free survival, PFS)定義為手術(shù)至患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的時間，隨訪以手術(shù)時間為始，截至2021年3月，隨訪12～104個月。

1.2 試劑兔抗人SOX9多克隆抗體(北京博奧森公司)，鼠抗人CD133單克隆抗體(武漢三鷹公司)，鼠抗人EpCAM多克隆抗體(武漢三鷹公司)，小鼠/兔聚合法檢測通用性試劑盒，DAB顯色試劑盒均購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1生物信息學(xué)分析 從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus database, GEO)網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov)選取MBC數(shù)據(jù)集(GSE 57544)，提取SOX9及常用的BCSC標(biāo)志物[7]CD44、CD24、EpCAM、CD133、ALDH1表達量，分析它們之間的相關(guān)性。

1.3.2免疫組化 42例MBC手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE和免疫組化EnVision兩步法染色。切片脫蠟水化，檸檬酸高壓抗原修復(fù)，PBS緩沖液沖洗，滴加一抗，4 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精染色，脫水透明后，鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判讀SOX9[8]以MBC中化生性成分細胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性；CD133[9]及EpCAM[10]以MBC中化生性成分胞膜、胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。評分標(biāo)準(zhǔn)：判讀MBC化生區(qū)域細胞陽性率及染色強度。(1)按陽性細胞百分比評分：陽性細胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。(2)按陽性細胞染色強度評分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：總分0～1分為陰性，2～12分為陽性，以染色總分的中位數(shù)作為區(qū)分SOX9、CD133和EpCAM高低表達的指標(biāo)。ER、PR以化生性區(qū)域腫瘤細胞核陽性細胞比例≥1%為陽性。HER-2表達0及1+為陰性，2+為不確定，3+為陽性。42例中有1例HER-2為2+病例，F(xiàn)ISH檢測為HER-2基因擴增，定為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 6.0.1軟件及SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，連續(xù)變量的差異性分析采用Mann-WhitneyU檢驗，應(yīng)用Spearman等級相關(guān)檢驗分析相關(guān)性，采用Kaplan-Meier曲線進行生存分析，采用Cox回歸模型進行多因素和單因素生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析MBC中SOX9與常見BCSC標(biāo)志物的相關(guān)性提取GEO數(shù)據(jù)集28例MBC患者的SOX9和常用BCSC標(biāo)志物的表達量，分析其相關(guān)性，結(jié)果顯示SOX9表達與CD44表達無相關(guān)性(rs=0.139，P=0.447)，與CD24表達呈正相關(guān)(rs=0.647，P<0.01)，與CD133表達呈正相關(guān)(rs=0540，P<0.01，圖1)，與EpCAM表達呈正相關(guān)(rs=0.554，P<0.01，圖1)，與ALDH1表達無相關(guān)性(rs=0.261，P=0.179)。雖然CD24與SOX9表達呈正相關(guān)，但通常以CD44和CD24聯(lián)合作為BCSC標(biāo)志物。故本實驗選用EpCAM與CD133作為BCSC標(biāo)志物。

圖1 生物信息學(xué)分析MBC中SOX9與BCSC標(biāo)志物CD133及EpCAM的相關(guān)性

2.2 MBC中SOX9的表達及其與臨床病理特征的相關(guān)性在MBC化生成分中SOX9表達定位于腫瘤細胞胞核，呈彌漫陽性(圖2)。SOX9陽性率為83.3%(35/42)，高表達率為47.6%(20/42)，免疫組化染色評分中位數(shù)為4，平均數(shù)為5±3.4。SOX9表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、高TNM分期呈正相關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、腫塊直徑、Ki-67增殖指數(shù)、ER表達、PR表達、HER-2表達及化生成分無關(guān)(表1)，Kaplan-Meier生存分析顯示，SOX9表達與患者3年P(guān)FS呈負相關(guān)(P<0.05，圖3)。

ABC

圖3 SOX9表達與MBC患者PFS的關(guān)系

2.3 MBC中CD133的表達及其與臨床病理特征的相關(guān)性MBC化生成分中CD133陽性定位于腫瘤細胞胞膜和胞質(zhì)，呈彌漫陽性(圖4)，CD133的陽性率為73.8%(31/42例)，高表達率為57.1%(24/42)，免疫組化染色評分中位數(shù)為4，平均數(shù)為4.5±2.7。CD133表達與遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、腫塊大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67增殖指數(shù)、ER表達、PR表達、HER-2表達及化生成分無關(guān)(表1)，Kaplan-Meier生存分析顯示，CD133表達與患者3年P(guān)FS呈負相關(guān)(P<0.05，圖5)。

ABC

圖5 CD133表達與MBC患者PFS的關(guān)系

2.4 MBC中EpCAM的表達及其與臨床病理特征的相關(guān)性在MBC化生成分中EpCAM陽性主要定位于腫瘤細胞胞膜和胞質(zhì)，腫瘤細胞中呈彌漫陽性(圖6)。EpCAM的陽性率為88.1%(37/42)，高表達率為45.2%(19/42)，免疫組化染色評分中位數(shù)為6，平均數(shù)為6±3.5。EpCAM表達與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P均<0.05)，與腫塊大小、TNM分期、遠處轉(zhuǎn)移、Ki-67增殖指數(shù)、ER表達、PR表達和HER-2表達無相關(guān)性(表1)。EpCAM在兩種以上化生成分型MBC中的表達高于單一化生成分型(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，EpCAM表達與患者3年P(guān)FS呈負相關(guān)(P<0.05，圖7)。

ABC

圖7 EpCAM表達與MBC患者PFS的關(guān)系

表1 MBC中SOX9、CD133及EPCAM的表達與臨床病理特征的相關(guān)性

2.5 MBC中SOX9、CD133和EPCAM表達的相關(guān)性免疫組化結(jié)果顯示，SOX9表達與CD133表達呈正相關(guān)(rs=0.502，P<0.01，圖8)，與EPCAM表達呈正相關(guān)(rs=0.529，P<0.01，圖8)。

圖8 MBC中SOX9與CD133、EpCAM表達的相關(guān)性

2.6 MBC與IBC-NST中SOX9、CD133和EpCAM表達的對比分析本實驗對MBC化生成分和IBC-NST成分中SOX9、CD133和EpCAM表達進行對比分析，38例同時具有化生成分和IBC-NST成分的病例中，SOX9、CD133和EpCAM在化生成分中的表達評分均高于IBC-NST成分(P<0.05，圖9)。

2.7 生存分析Cox單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，SOX9高表達、CD133高表達與MBC患者的3年P(guān)FS相關(guān)(P<0.05，表2)，選取P<0.12的因素進行Cox多因素分析，結(jié)果顯示SOX9是影響患者3年P(guān)FS的獨立危險因素(P<0.05，表2)。

表2 MBC患者PFS的Cox多因素和多因素分析

3 討論

CSC是腫瘤細胞中的一種亞群，其具有高度的自我更新能力和啟動腫瘤發(fā)生的能力，對腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移起關(guān)鍵作用[11]。在乳腺癌中，轉(zhuǎn)移是受多種信號通路嚴格調(diào)控的一種過程，大多數(shù)細胞具有脫離原本基質(zhì)便凋亡的特征，但CSC可以存活并在遠處建立轉(zhuǎn)移性病變，因此CSC促進了乳腺癌的轉(zhuǎn)移[12]；同時，研究表明CSC在乳腺癌中促進了腫瘤血管生成擬態(tài)的形成，并可分化為血管內(nèi)皮細胞，在腫瘤血管的生成中發(fā)揮重要作用[13]，并且CSC有著抗凋亡分子的高表達以及高效的DNA修復(fù)機制，使得其對放療及化療表現(xiàn)出高度的抵抗力，這是腫瘤復(fù)發(fā)的重要因素[14]。普遍認為，MBC富含CSC的特點使其伴隨較差的預(yù)后[4]，因此MBC中CSC調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究對于預(yù)測MBC的預(yù)后和防止復(fù)發(fā)至關(guān)重要。

SOX9是SOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在胚胎發(fā)育和干細胞維持中起關(guān)鍵作用[5]。越來越多的證據(jù)表明，SOX9可以調(diào)節(jié)CSC，促進癌癥的進展。Domenici等[15]發(fā)現(xiàn)在IBC-NST中，SOX2-SOX9信號軸控制BCSC的含量，并且是表達BCSC標(biāo)志物ALDH1所必須的，是維持BCSC的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。在三陰型乳腺癌中，Strekalova等[16]證明可以通過限制MAT2A-SOX9軸抑制BCSC群體，從而抑制癌癥的進展，這些研究證實了SOX9在維持BCSC并以此促進乳腺癌進展中的重要作用。本實驗中，SOX9的表達與MBC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，表明SOX9在MBC的轉(zhuǎn)移過程可能具有重要作用。除了促進轉(zhuǎn)移，SOX9還與MBC患者PFS關(guān)系密切相關(guān)，本組病例顯示，SOX9高表達與高TNM分期呈正相關(guān)，與患者3年P(guān)FS呈負相關(guān)。這些與既往SOX9在乳腺癌中表達的研究一致[17]。同時Cox多因素分析顯示，SOX9的表達與患者3年P(guān)FS密切相關(guān)[P<0.05，HR=29.023(1.850～455.380)，置信區(qū)間較大或與樣本量較少有關(guān)]，是影響患者預(yù)后的獨立危險因素，這些結(jié)果表明SOX9與MBC的進展密切相關(guān)。

圖9 A.SOX9在MBC化生性成分和IBC-NST成分中的表達；B.CD133在MBC化生性成分和IBC-NST成分中的表達；C.EpCAM在MBC化生性成分和IBC-NST成分中的表達

CD133和EpCAM常作為BCSC標(biāo)志物，Wright等[18]在免疫缺陷小鼠的乳腺癌細胞中分離出的CD133+細胞具有更高的集落形成效率、增殖率和更強的成瘤能力。Hiraga等[19]從乳腺癌細胞系中篩選出的EpCAM+細胞具有自我更新和分化的潛力，給小鼠心內(nèi)注射EpCAM+乳腺癌細胞，小鼠發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的概率明顯增加，提示乳腺癌CD133+和EpCAM+細胞具有BCSC的特征。乳腺癌中EpCAM與CD133的表達通常與不良預(yù)后有關(guān)，Brugnoli等[20]研究結(jié)果顯示，在三陰型乳腺癌中CD133+和EpCAM+細胞具有高增殖率和高侵襲力，并且與三陰型乳腺癌的惡性程度直接相關(guān)。本實驗中，CD133和EpCAM的表達與患者3年P(guān)FS呈負相關(guān)；CD133表達與遠處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，EpCAM表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；EpCAM在兩種以上化生成分的MBC中表達高于單一化生成分，存在兩種以上化生成分是導(dǎo)致MBC復(fù)發(fā)和生存率降低的不良因素[21]，這些結(jié)果提示CD133和EpCAM與MBC患者的腫瘤進展相關(guān)。

本組生物信息學(xué)分析和免疫組化結(jié)果均顯示SOX9表達與CD133和EpCAM表達呈正相關(guān)，這與文獻中報道的提示SOX9在癌癥中通過調(diào)控BCSC并加速腫瘤的惡性進展結(jié)果一致[22]。同時，MBC是富含BCSC的腫瘤[4]，本實驗結(jié)果顯示，EpCAM和CD133在MBC化生成分中的表達高于非特殊型成分，證明了MBC比IBC-NST富含干性特征，并因此具有更差的預(yù)后。這些結(jié)果表明，在MBC中SOX9表達與BCSC標(biāo)志物關(guān)系密切，可能作為MBC中的BCSC調(diào)控因子，并以此促進MBC的進展。