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        PCR技術(shù)對(duì)發(fā)酵食品中微生物檢測(cè)的效果分析

        2022-09-27 02:17:48支曉潔安康市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)中心
        中國(guó)食品 2022年18期
        關(guān)鍵詞:堿基引物食品

        ⊙ 文|支曉潔 安康市質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)中心

        食品中微生物含量的檢測(cè)主要包括菌落總數(shù)、大腸桿菌群落以及病原微生物三個(gè)方面的檢測(cè)。檢測(cè)人員需要先對(duì)食品進(jìn)行特殊的處理,在相對(duì)特定的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng),然后檢測(cè)相關(guān)重要指標(biāo)。除了益生菌之外,其他細(xì)菌群落的數(shù)量越多,就代表著食品中因?yàn)槲⑸飳?dǎo)致的污染越嚴(yán)重,最終導(dǎo)致食品的安全性能較差。傳統(tǒng)的顯微鏡鏡檢法主要是利用微生物的形態(tài)以及數(shù)量來進(jìn)行檢測(cè),雖然靈敏度相對(duì)比較高,但是檢測(cè)的流程較為復(fù)雜,檢測(cè)的時(shí)間也很長(zhǎng),效率不高。再加上部分食品的保質(zhì)期相對(duì)較短,傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性就很容易影響食品在市場(chǎng)上的流通。為此,在發(fā)酵食品的微生物檢測(cè)中探求一種準(zhǔn)確且快速的檢測(cè)方法,對(duì)于預(yù)防食品安全問題的發(fā)生具有十分重要的意義。

        一、檢測(cè)與方法

        四甲基吡嗪(TTMP)是一種含氮的雜環(huán)化合物,天然存在于水果、堅(jiān)果、豆制品、乳制品以及各種酒類等發(fā)酵食品中。因?yàn)榘l(fā)酵食品中TTMP的含量相對(duì)較低,而且相對(duì)于其他組成成分來說較為復(fù)雜,所以要想對(duì)發(fā)酵食品中微生物的含量進(jìn)行檢測(cè),必須首先對(duì)發(fā)酵食品進(jìn)行前處理,去除一些干擾物質(zhì),并且增加TTMP的含量。前處理最常使用的是溶劑萃取技術(shù)、分散液相微萃取技術(shù)以及固相微萃取技術(shù)中的頂空萃取方法。

        (1)溶劑萃取技術(shù)。在溶劑萃取方法中,常用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取,通過三氯甲烷來萃取食品中的TTMP,再使用0.5mol/L的鹽酸溶液將TTMP萃取到由金屬離子組成的水溶液狀態(tài),然后使用高效液相色譜來進(jìn)行檢測(cè),回收率高達(dá)85%以上。另一種萃取方法就是使用重蒸溶液對(duì)飽和狀態(tài)下的氯化鈉溶液進(jìn)行萃取,通過調(diào)節(jié)氫離子的濃度可以將其逐漸分成酸性、堿性以及中性三個(gè)部分,將其干燥之后再使用氣相色譜來進(jìn)行檢測(cè)。

        (2)分散液相微萃取技術(shù)。分散液相微萃取技術(shù)能夠減少有機(jī)溶劑的使用,并且提高檢測(cè)效率,在樣品的前處理工作中應(yīng)用廣泛。通過分散液相微萃取技術(shù)也可以提取發(fā)酵食品中TTMP的含量,先用400μmol/L的二氯甲烷來進(jìn)行萃取,再用4mL的乙醇溶劑來進(jìn)行分散,回收率可高達(dá)97%以上。為了減少萃取所用的時(shí)間,還可以利用超聲以及渦旋的方式來進(jìn)行輔助,通過60s的超聲或者是渦旋可以使萃取的過程達(dá)到平衡狀態(tài)。

        (3)固相微萃取技術(shù)中的頂空萃取方法。固相微萃取技術(shù)中的頂空萃取方法無須使用溶劑,檢測(cè)成本較低,檢測(cè)速度相對(duì)較快,因此被廣泛應(yīng)用在低分子或者低沸點(diǎn)的化合物檢測(cè)中。

        通過上述方法可以得知TTMP生成的路徑,具體如圖1所示。因?yàn)楹芏嗍称分形⑸锏臐舛认鄬?duì)較低,所以在對(duì)樣品進(jìn)行前處理之后要使其濃度達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn),而且樣品前處理之后的反應(yīng)很難使其中的分子靈敏度達(dá)到極限狀態(tài),還容易出現(xiàn)細(xì)菌數(shù)量損失的情況,因此需要將其內(nèi)部核酸顯露出來,這樣才可以準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。處理的方法大多是對(duì)其進(jìn)行加熱、重復(fù)地凍融以及利用化學(xué)試劑來進(jìn)行裂解,當(dāng)直接使用化學(xué)試劑來進(jìn)行細(xì)菌裂解時(shí),需要注意細(xì)菌中的蛋白質(zhì)可能會(huì)壓抑Taq酶的活性。只要細(xì)菌濃度不超過150cfu/μL,細(xì)菌裂解之后的核酸就不需要再進(jìn)一步純化。使用FHLP和FGLP兩種膜進(jìn)行水樣過濾之后,經(jīng)過多次的凍融以及在不移走過濾膜的前提下,可以對(duì)其進(jìn)行核酸提取。

        圖1:TTMP生成路徑示意圖

        聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱PCR)是一種可以快速對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增的方法,可以使某一特定序列上的微量DNA片段在非常短的時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增通常是由20-40個(gè)聚合酶鏈反應(yīng)組合而成,并且每一個(gè)反應(yīng)都是由高溫變性、低溫退火、適溫延伸這三個(gè)步驟組合而成。在經(jīng)過高溫的過程中,DNA性質(zhì)發(fā)生改變,氫鍵被打開之后,雙鏈就可以轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湥@一步驟就可以作為擴(kuò)增過程中的模板;在經(jīng)過低溫的過程中,左端和右端的引物可以與擴(kuò)增模板中的兩條單鏈進(jìn)行互補(bǔ),這一過程稱為退火;在達(dá)到適合溫度的狀態(tài)時(shí),利用DNA中的聚合酶可以將四種脫氧核苷的三磷酸酯按照堿基互補(bǔ)的方式來進(jìn)行配對(duì),將其增加到引物的末端位置并按照一定方向延伸到新的DNA中,將單鏈模式變?yōu)殡p鏈模式,然后將雙鏈模式下的DNA重復(fù)上述的過程,可以使引物的DNA數(shù)量成倍增加。

        通常情況下,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在進(jìn)行變性過程中,溫度應(yīng)該維持在95℃,如果還沒進(jìn)行擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的聚合酶所占比例過高,就可以適當(dāng)提高溫度。退火狀態(tài)下的溫度跟DNA堿基中聚合酶的含量存在一定關(guān)系,具體如下式所示:

        在上式中,T表示解鏈的溫度,和表示DNA堿基中聚合酶的數(shù)量,和表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。通過在T的附近進(jìn)行測(cè)試,確定退火狀態(tài)下最佳的溫度形態(tài)。如果延伸的溫度在75℃時(shí),DNA中聚合酶的速度為1500(堿基)/min,那么聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)就是將DNA擴(kuò)增模板、左右端引物、聚合酶、混合液、混沖液、雙蒸水以及鎂離子等混合至微型管子中,并在儀器上完成。其中,鎂離子為聚合酶中活力因子所需要的金屬離子,濃度通常為2-3.5mol/L。因?yàn)橐锏腄NA數(shù)量是成倍增加的,所以可以得到聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)構(gòu),如圖2所示。

        圖2:聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增結(jié)構(gòu)示意圖

        使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來進(jìn)行微生物含量檢測(cè),就是需要對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增。從理論上來說,就是在微生物含量高的區(qū)域設(shè)置左右端引物,這樣就可以將微生物利用片段擴(kuò)散而出。如果在微生物含量屬特異性區(qū)域內(nèi)設(shè)置左右端引物,那么只有本屬狀態(tài)下的微生物才可以被擴(kuò)散;如果在微生物含量種特異性區(qū)域內(nèi)設(shè)置左右端引物,那么就只有特定區(qū)域內(nèi)的微生物才可以被擴(kuò)散。最終可以根據(jù)已了解的微生物信息,設(shè)計(jì)出一種特定的左右端引物,來進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。一旦擴(kuò)增的產(chǎn)物達(dá)到一定長(zhǎng)度,就說明擴(kuò)增的模板為該微生物的DNA,表示待測(cè)微生物存在一定的數(shù)量。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的時(shí)間較短,可以將傳統(tǒng)檢測(cè)方法所需的數(shù)天縮短至幾小時(shí)。

        例如,用瓊脂糖凝膠電泳法可以準(zhǔn)確檢測(cè)出發(fā)酵食品中的微生物含量,由于凝膠電泳法中的瓊脂糖質(zhì)量在1%-2.5%,并且質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)根據(jù)片段大小而決定,因此等待分離狀態(tài)下的片段中分子含量越小,就代表瓊脂糖質(zhì)量越大。使用凝膠電泳法之后還需要使用溴化乙錠進(jìn)行染色,將其插入到DNA的堿基中,經(jīng)過紫外線放射后呈現(xiàn)出熒光,這樣就可以準(zhǔn)確地識(shí)別出發(fā)酵食品中的微生物及其含量大小。

        二、應(yīng)用與分析

        為了驗(yàn)證本研究提出的微生物含量檢測(cè)方法的可靠程度和實(shí)際應(yīng)用效果,本次檢驗(yàn)主要對(duì)發(fā)酵食品樣品中最主要的三種微生物進(jìn)行檢測(cè),分別為酵母菌、霉菌以及細(xì)菌,并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析,以此判定該發(fā)酵食品樣品的安全性。

        實(shí)驗(yàn)所需要的主要材料是蛋白胨、瓊脂、酵母浸膏以及蒸餾水,在進(jìn)行檢測(cè)之前還需要對(duì)發(fā)酵食品中的微生物進(jìn)行培養(yǎng),具體培養(yǎng)方法如下:一是原始溶液制作。從送檢的發(fā)酵食品中取出2份質(zhì)量相同(均為12g)的樣品裝入燒杯中,加入1500mL的生理鹽水,其中蛋白胨的含量在1%左右,混合之后將其攪拌3-5h;在無菌的條件下,使用洗脫液進(jìn)行過濾處理,混合均勻即可。二是微生物培養(yǎng)。取5mL的原始溶液,放置在80℃的水中靜置10min,再取1mL靜置之后的原始溶液、1mL的十進(jìn)制稀釋液以及15mL的瓊脂混合均勻,待其凝固之后,使用5mL相同的培養(yǎng)基對(duì)其表層進(jìn)行覆蓋,并將平皿倒置在厭氧罐中,最后在恒溫培養(yǎng)箱中對(duì)其進(jìn)行24-96h的培養(yǎng)。

        在準(zhǔn)備好所需要的材料之后,對(duì)微生物的培養(yǎng)分別設(shè)置24h、48h、72h、96h這4個(gè)不同的時(shí)間梯度,并且在攪拌溫度、攪拌速度以及攪拌時(shí)間均相同的情況下,分別使用兩種不同方法進(jìn)行檢測(cè),所得到的結(jié)果對(duì)比如圖3所示。

        圖3:不同微生物含量檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比圖

        由圖3可知,培養(yǎng)時(shí)間從0h增加到24h時(shí),傳統(tǒng)方法檢測(cè)出的微生物含量為2×10cfu·g,生物化學(xué)方法檢測(cè)出的微生物含量則為6×10cfu·g;培養(yǎng)時(shí)間從24h增加到72h時(shí),雖然微生物含量的發(fā)展?fàn)顩r是趨于平緩的狀態(tài),但是兩種方法檢測(cè)出的微生物含量還是存在一定差距,傳統(tǒng)方法檢測(cè)出的微生物含量為2×10-4×10cfu·g,生物化學(xué)方法檢測(cè)出的微生物含量則為6×10-8×10cfu·g;培養(yǎng)時(shí)間從72h增加到96h時(shí),生物化學(xué)方法檢測(cè)出的微生物含量明顯增多,具體結(jié)果為10×10cfu·g,而傳統(tǒng)方法檢測(cè)出的微生物含量只有5×10cfu·g。

        此次研究的微生物含量檢測(cè)方法是在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上,結(jié)合核酸提取以及PCR擴(kuò)增技術(shù)來提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度以及有效縮短檢測(cè)時(shí)間,為有效預(yù)防食品安全問題的發(fā)生以及完善食品微生物檢測(cè)體系提供了更加完整的理論基礎(chǔ)。由于此方法也有一定的局限性,對(duì)實(shí)驗(yàn)操作過程要求較高,因此今后可以進(jìn)一步探索高效且準(zhǔn)確度高的技術(shù)手段,從而更加準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中微生物的含量,以此達(dá)到有效預(yù)防食物中毒的效果。

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