張 良，劉媛潔，嚴美婷，張超鳳

（1.江西省食品發(fā)酵研究所，江西宜春 336000；2.江西醫(yī)學高等?？茖W校，江西上饒 334000）

青錢柳又名搖錢樹，廣泛分布于浙江、江西、湖北和湖南等地，是中國特有、國家二級保護的珍惜樹種。青錢柳葉中含有黃酮、多糖、三萜、有機酸類等多種天然功能性活性物質，在降血糖、降血壓、降血脂、抗氧化等方面具有一定的功效?；谇噱X柳葉的藥食兼用的價值，青錢柳葉茶已通過美國食品藥品管理局的認證，青錢柳葉已列入中國新資源食品原料目錄。青錢柳多糖、黃酮、三萜是青錢柳葉中主要的活性物質并具有較好的抗氧化活性。

酶菌協(xié)同發(fā)酵是指原料經(jīng)酶解工藝后，再經(jīng)微生物菌種發(fā)酵的過程。酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝應用于青錢柳葉過程，能提高天然活性物質的溶出量，同時可去除青錢柳的苦澀味。楊潔芳等利用酶菌協(xié)同工藝制備的大豆肽含量與實驗室制備的酶解肽相比，其DPPH 自由基清除率提高106.92%，同時解決了單一酶解時酶解產(chǎn)物帶有苦味的問題。張倩茹等利用酶菌協(xié)同發(fā)酵玉米芯制備的木聚糖，與對照組相比木聚糖含量顯著提高了257%。研究表明酶菌協(xié)同發(fā)酵效果優(yōu)于菌和酶單獨使用時的效果。毛傳亮等研究了青錢柳葉醇提后的水提物對DPPH 自由基的清除率為91.29%，鄭曉杰等發(fā)現(xiàn)浙江文成8 月份青錢柳的DPPH 清除能力為162.26 μmol AAE/g dm。但關于青錢柳葉酶解或發(fā)酵后的抗氧化活性的研究較少。

本研究以產(chǎn)自江西九江修水縣的青錢柳葉為原料，應用酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝制備高抗氧化活性的青錢柳發(fā)酵粉，解決了單一酶解時青錢柳有苦澀味問題和單一微生物發(fā)酵酶系不足等問題，對制備適口性強和高抗氧化活性成分的產(chǎn)品有一定的產(chǎn)業(yè)化意義，為青錢柳葉的精深加工和高值化利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青錢柳葉 江西九江市修水縣；半纖維素酶（10 萬 U/g）、纖維素酶（10 萬 U/g）寧夏和氏璧生物技術有限公司；植物乳桿菌（）、釀酒酵母（）江西省食品發(fā)酵研究所菌種保藏中心提供；DPPH（純度≥98%）Sigma 公司；MRS 培養(yǎng)基、PDA 培養(yǎng)基北京陸橋技術股份有限公司；其他試劑均為分析純。

752N 紫外可見分光光度計 上海儀電分析；HHS-6恒溫水浴鍋 南通三思機電有限公司；FA1204B 電子天平 上海精科天美有限公司；SH-100C 恒溫搖床 英檢達儀器（重慶）有限公司；KH22R 高速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；LGJ-100F 凍干機 上海豫明儀器有限公司；250B 生化培養(yǎng)箱蘇州威爾實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 挑取4 環(huán)斜面植物乳桿菌接種到裝有80 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶后，恒溫搖床（35 ℃，140 r/min）培養(yǎng)24 h；挑取4 環(huán)斜面釀酒酵母接種到裝有80 mL PDA 培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶后，恒溫搖床（30 ℃，140 r/min）培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)完成的植物乳桿菌和釀酒酵母菌液按照一定的質量比混合后，制備成發(fā)酵用的混合菌種。

1.2.2 青錢柳酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝 將經(jīng)干燥粉碎后過20 目篩的青錢柳葉，按照一定的料液比，將青錢柳葉細粉和蒸餾水裝于250 mL 三角瓶中搖勻。按照青錢柳葉細粉質量的百分比添加復合酶（纖維素酶和半纖維素酶）于裝有青錢柳細粉液的三角瓶中，在55 ℃、pH5.0 條件下，恒溫水浴酶解3.0 h。按照酶解后酶解液總質量的百分比添加蔗糖，經(jīng)121 ℃、0.12 MPa 高壓滅菌20 min 后冷卻，按照酶解液總質量的百分比接種混合菌（植物乳桿菌和釀酒酵母按一定質量比混合），置于恒溫搖床內(nèi)（32 ℃，140 r/min）培養(yǎng)36 h。在5 ℃和8000 r/min 條件下，發(fā)酵液離心15 min 后取上清液，50 ℃下旋轉濃縮后，真空冷凍干燥（預凍溫度為-40 ℃，預凍時間為6 h，干燥氣壓為50 Pa，干燥時間48 h）獲得青錢柳發(fā)酵粉。

1.2.3 單因素實驗 按照1.2.2 的工藝條件，固定單因素實驗條件：料液比為1:8 g/mL，復合酶添加量為0.6%，復合酶（纖維素酶和半纖維素酶）質量比為1:1 g/g，酶解時間為3.0 h，蔗糖添加量為6%，混合菌添加量為4%，混合菌（植物乳桿菌和釀酒酵母）質量比為1:1 g/g，發(fā)酵時間為36 h。

分別考察料液比（1:4、1:8、1:12、1:16、1:20、1:24 g/mL）、復合酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、復合酶質量比（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1 g/g）、酶解時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、蔗糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、混合菌添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、混合菌質量比（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1 g/g）和發(fā)酵時間（20、28、36、42、50、58 h）對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響。

1.2.4 PB 試驗 在1.2.3 的實驗基礎上，以料液比、復合酶添加量、復合酶質量比、酶解時間、蔗糖添加量、混合菌添加量、混合菌質量比、發(fā)酵時間為因素水平值，采用PB 試驗來篩選青錢柳發(fā)酵粉對DPPH自由基清除率影響顯著的因素。PB 試驗設計見表1。

表1 PB 試驗設計因素及水平表Table 1 Factors and levels of PB test design

1.2.5 響應面試驗 在1.2.4 實驗基礎上，以具有顯著性的響應因素復合酶添加量、復合酶質量比和混合菌添加量為自變量，以青錢柳發(fā)酵粉對DPPH 自由基清除率為響應值，設計響應面試驗，具體設計見表2。

表2 響應面試驗設計Table 2 Box-Behnken test design

1.2.6 DPPH 自由基清除率的測定 參照王珊珊等的方法進行測定。青錢柳發(fā)酵粉用85%的乙醇配制成不同濃度（5、10、20、40、80 mg/mL）的待測液。取20 mg/mL 濃度的待測液，按照A、A和A的實驗方法，溶液混勻避光靜置30 min 后測吸光度（517 nm）。

式中，A為2 mL 的待測液與等體積DPPH乙醇溶液混合反應后的吸光值；A為2 mL 待測液與等體積乙醇（85%）溶液混合后的吸光值；A為2 mL 乙醇（85%）溶液與等體積DPPH 乙醇溶液混合后的吸光值。

1.2.7 青錢柳發(fā)酵粉中主要成分的測定

1.2.7.1 青錢柳多糖含量的測定 苯酚-硫酸法，參照SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚-硫酸法》。

1.2.7.2 青錢柳總黃酮含量的測定 分光光度計法，參照SN/T 4592-2016《出口食品中總黃酮的測定》。

1.2.7.3 青錢柳總三萜含量的測定 分光光度計法，參照NY/T 3676-2020《靈芝中總三萜含量的測定 分光光度法》。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復三次，數(shù)據(jù)以平均值±標準差（SD）表示，單因素實驗數(shù)據(jù)用Excel 2019 整理并作圖。采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計軟件進行PB 和響應面試驗設計、數(shù)據(jù)處理及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖1 可知，隨著料液比的逐漸增加，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率呈先增大后略減小的趨勢。當料液比為1:12 g/mL 時，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率最大。分析原因可能是隨著料液比的增加，利于青錢柳抗氧化活性物質從組織細胞內(nèi)溶出到周圍溶液中，但過大的料液比也會造成有效成分的損失，從而導致青錢柳發(fā)酵粉的DPPH自由基清除率降低。同時，料液比太小則不利于青錢柳的充分發(fā)酵，料液比太大會導致發(fā)酵液中青錢柳抗氧化活性物質含量的相對減少。選擇料液比為1:8～1:16 g/mL 進行PB 試驗。

圖1 料液比對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.2 復合酶添加量對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖2 可知，隨著復合酶添加量的增加，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)先增加后逐漸減少的趨勢。當復合酶添加量為0.8%時，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率達到最大值。分析原因可能是復合酶添加量低時，青錢柳抗氧化活性物質等溶出較少，發(fā)酵液中營養(yǎng)元素也不是發(fā)酵菌的最佳生長條件。隨著復合酶添加量的增加，底物和酶的酶解效果較好，青錢柳抗氧化活性物質等溶出較多，但發(fā)酵菌生長較快，一些活性物質等營養(yǎng)成分消耗也較快，導致青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率略微下降。選擇復合酶添加量為0.6%～1.0%進行PB 試驗。

圖2 復合酶添加量對青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of compound enzyme added amount on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.3 復合酶質量比對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖3 可知，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH自由基清除率隨著復合酶（纖維素酶與半纖維素酶）中纖維素酶的質量比的增大而增加，即當復合酶質量比為2:1 時，DPPH 自由基清除率達最大值。繼續(xù)增加纖維素酶的質量占比，DPPH 自由基清除率略有下降。分析原因可能是，隨著纖維素酶質量比的增加，酶解出的青錢柳多糖、黃酮等抗氧化活性物質逐漸增加。發(fā)酵菌在較低的纖維素酶質量比時，生長較慢，水解出的青錢柳活性成分較少；發(fā)酵菌在較高的纖維素酶質量比時，生長較快，消耗青錢柳多糖、黃酮等營養(yǎng)活性物質較快，DPPH 自由基清除率略有降低。選擇復合酶質量比為1:1～3:1 g/g 進行PB 試驗。

圖3 復合酶質量比對青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of compound enzyme mass ratio on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.4 酶解時間對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖4 可知，隨著酶解時間的增加，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)先增加后緩慢減少的趨勢。當酶解時間達2.5 h 后，繼續(xù)增加酶解時間，青錢柳發(fā)酵液中抗氧化活性物質會受酶解作用的影響發(fā)生部分水解，導致青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率降低。選擇酶解時間為2.0～3.0 h 進行PB 試驗。

圖4 酶解時間對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.5 蔗糖添加量對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖5 可知，隨著蔗糖添加量的增加，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率呈先遞增后略降低的趨勢。當蔗糖添加量為8%時，DPPH 自由基清除率達最大值。分析原因可能是作為培養(yǎng)基的蔗糖濃度過高，發(fā)酵菌種的細胞的滲透壓過大，菌體生長緩慢，青錢柳發(fā)酵液中抗氧化活性成分含量減少，導致DPPH 自由基清除率降低。選擇蔗糖添加量為6%～10%進行PB 試驗。

圖5 蔗糖添加量對青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of sucrose addition on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.6 混合菌添加量對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖6 可知，青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率隨著混合菌添加量的增加呈先增加后略降低的趨勢。當混合菌添加量為5%時，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率達最大值。繼續(xù)增加混合菌添加量，DPPH 自由基清除率略下降。分析原因可能是混合菌添加量達到一定量后繼續(xù)增加，會使培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質不能滿足發(fā)酵菌種的生長，同時消耗培養(yǎng)基中的多糖、黃酮等活性物質作為營養(yǎng)來滿足菌種的生長，導致青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率降低。選擇混合菌添加量為4%～6%進行PB 試驗。

圖6 混合菌添加量對青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of mixed bacteria added amount on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.7 混合菌質量比對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖7 可知，DPPH 自由基清除率隨混合菌（植物乳桿菌和釀酒酵母）中植物乳桿菌的增加，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢?；旌暇谏L過程中，會分泌不同的水解酶，有利于細胞組織結構中抗氧化活性物質釋放到發(fā)酵液中。混合菌質量比的不同，菌種自身生長和代謝所需要的營養(yǎng)物質不一樣，菌種間相互生長和代謝的制約程度不一樣，由圖7 可以看出，當混合菌質量比為2:1 時，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率達最大值。選擇混合菌質量比為1:1～3:1 g/g 進行PB 試驗。

圖7 混合菌質量比對青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effect of mass ratio of mixed bacteria on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.1.8 發(fā)酵時間對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響 由圖8 可知，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率隨著發(fā)酵時間的延長，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當發(fā)酵時間為42 h 時，DPPH 自由基清除率達最大值，為69.2%。發(fā)酵時間超過42 h 后，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率有所下降，分析原因可能是發(fā)酵菌種進入生長的衰老期，分泌的酶量不再增加，同時發(fā)酵菌產(chǎn)生了能降解青錢柳抗氧化活性物質的酶，使DPPH 自由基清除率有所降低。選擇發(fā)酵時間為36～50 h 進行PB 試驗。

圖8 發(fā)酵時間對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響Fig.8 Effect of fermentation time on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.2 PB 試驗結果

表3 與表4 分別為PB 試驗設計及結果和方差分析。

表3 PB 設計的各因素水平及響應值Table 3 Experimental design and response results of PB design

表4 PB 設計方差分析Table 4 Analysis of variance of PB design

對表3 中的實驗數(shù)據(jù)進行分析，結果見表4。模型的值為0.0178，表示該模型（＜0.05）顯著；從各因素的值可以看出B（復合酶添加量）、C（復合酶質量比）和F（混合菌添加量）對青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率的影響顯著（＜0.05）。因此選擇復合酶添加量、復合酶質量比和混合菌添加量共3 個因素進行響應面試驗。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計與結果分析 在2.1 和2.2的實驗結果的基礎上，固定不顯著影響因素料液比1:12 g/mL、酶解時間2.5 h、蔗糖添加量8%、混合菌質量比2:1 g/g、發(fā)酵時間42 h。以復合酶添加量（X）、復合酶質量比（X）和混合菌添加量（X）3 個因素進行響應面試驗。響應面試驗設計及結果見表5。

對表5 進行統(tǒng)計分析，進而獲得實驗數(shù)據(jù)的方差分析（見表6）。經(jīng)多元回歸擬合，模型的二次多項式方程為：

表5 響應面試驗設計及結果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiment

表6 響應面試驗方差分析Table 6 Analysis of variance in Box-Behnken experiment

由表6 可知，該模型＜0.0001，表明建立的模型極顯著（＜0.01）；失擬項值不顯著，表明建立的模型擬合度較好；方程的校正決定系數(shù)和決定系數(shù)分別為0.9764 和0.9897，表明約有97.64%的響應值變化能由該模型進行解釋，實際實驗與模型建立的方程擬合度較好，能用于分析和預測青錢柳酶菌協(xié)同發(fā)酵的工藝優(yōu)化。對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響極顯著（＜0.01）的因素為X、X、XX、X、X、X，對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率影響顯著的因素為XX（＜0.05），其他因素均不顯著（＞0.05）。模型的值越大對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響越大。可見，各因素對酶菌協(xié)同發(fā)酵青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率的影響程度為：X（混合菌添加量）＞X（復合酶添加量）＞X（復合酶質量比）。

對回歸方程進行響應面分析，自變量因素相互間交互作用的響應曲面圖見圖9。自變量因素對響應值的影響與響應面坡度陡峭程度呈正相關；等高線呈橢圓形的程度與兩個自變量交互作用的程度呈正相關。由圖9 可知，對響應值的影響較大的交互作用為XX和XX。隨著各因素數(shù)值的增大，青錢柳發(fā)酵粉對DPPH 自由基清除率呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，響應面呈凸型陡峭曲面，對應的等高線呈橢圓形，表明XX和XX的交互作用顯著，DPPH自由基清除率存在極大值。

圖9 交互項對青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率影響的響應面Fig.9 Response surface analysis of the effects of interaction terms on DPPH free radical scavenging rate of Cyclocarya paliurus fermentation powder

2.3.2 最優(yōu)工藝條件及驗證試驗 根據(jù)模型的回歸方程分析獲得最佳的青錢柳酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝條件為：料液比1:12 g/mL、復合酶添加量0.76%、復合酶質量比2.17:1 g/g、酶解時間2.5 h、蔗糖添加量8%、混合菌添加量5.83%、混合菌質量比2:1 g/g、發(fā)酵時間42 h。在此最佳條件下，青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率理論上可達82.84%?？紤]具體實驗的可操作性，修正最佳條件為：料液比1:12 g/mL、復合酶添加量0.80%、復合酶質量比2.20:1 g/g、酶解時間2.5 h、蔗糖添加量8%、混合菌添加量5.80%、混合菌質量比2:1 g/g、發(fā)酵時間42 h，在此條件下，得出實際的DPPH 自由基清除率為82.17%（RSD=1.19%），與預測值的相對誤差為0.81%，說明該模型準確度良好。

2.4 青錢柳發(fā)酵粉主要成分分析

按照1.2.2 工藝條件，對青錢柳葉細粉未進行酶解和發(fā)酵工藝，制備成青錢柳粉對比樣品，再與青錢柳發(fā)酵粉進行主要活性成分比對，見表7。

表7 青錢柳發(fā)酵粉的主要活性成分分析Table 7 Analysis of main active components of Cyclocarya paliurus fermented powder

由表7 可知，青錢柳葉細粉經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后，與未經(jīng)處理的青錢柳粉相比，青錢柳發(fā)酵粉中的多糖、總黃酮和總三萜等抗氧化活性物質成分含量顯著增加（＜0.05）。在酶解過程中，青錢柳葉細粉經(jīng)纖維素酶和半纖維素酶的作用后釋放出多糖等活性物質和營養(yǎng)成分，再經(jīng)植物乳桿菌和酵母菌的發(fā)酵后，進一步促進了功能性活性成分的溶出，同時一些抗氧化活性物質由結合態(tài)轉化為游離態(tài)，抗氧化活性成分含量增加的同時，DPPH 自由基清除率也顯著增加（＜0.05）。

3 結論

以青錢柳發(fā)酵粉DPPH 自由基清除率為響應值，在單因素實驗后通過PB 和響應面試驗優(yōu)化了青錢柳酶菌協(xié)同發(fā)酵工藝，最終獲得最佳的工藝條件為：料液比1:12 g/mL、復合酶添加量0.80%、復合酶質量比2.20:1 g/g、酶解時間2.5 h、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.80%、混合菌質量比2:1 g/g、發(fā)酵時間42 h。在此條件下，青錢柳發(fā)酵粉DPPH自由基清除率為82.17%。

青錢柳葉細粉經(jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵后，與未處理的青錢柳粉對比，青錢柳發(fā)酵粉的DPPH 自由基清除率增加了159.9%；青錢柳多糖含量為8.26 g/100 g，增加了194.0%；青錢柳總黃酮含量為9.15%，增加了72.0%；青錢柳總三萜含量為9.28%，增加了52.6%?？梢姡?jīng)酶菌協(xié)同發(fā)酵制備的青錢柳發(fā)酵粉中多糖、總黃酮、總三萜等抗氧化物質顯著增加，為青錢柳的精深加工和高效利用提供新的開發(fā)思路和途徑。