王 亮，張艷珍，王 菲

(青海省輕工業(yè)研究所有限責(zé)任公司，青海 西寧 810001)

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)，茄科枸杞屬多棘刺灌木，有較多分枝，其分枝斜升或橫臥于地面，白色或灰白色[1]，漿果球形，皮薄，皮熟后紫黑色，果實(shí)里面含豐富的花青素，極易溶于水[2]，屬天然的水溶性花色甙黃酮類(lèi)。藏醫(yī)用于治療心熱病、心臟病、降低膽固醇[3]、興奮大腦神經(jīng)、增強(qiáng)免疫功能、防治癌癥、抗氧化[4]、抗衰老[5]、益精明目[6]、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等且藥效顯著[7]。白刺(NitrariatangutorumBobr.)為蒺藜科，白刺屬匍匐性小灌木，俗稱地棗、地椹子、沙櫻桃等。白刺果實(shí)中營(yíng)養(yǎng)成分和醫(yī)藥保健活性成分種類(lèi)多，含量豐富[8]。白刺果汁中含有豐富的胡蘿卜素、類(lèi)胡蘿卜素、維生素、氨基酸[9]，總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常見(jiàn)水果，是沙棘的4倍。

花色苷是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類(lèi)化合物，廣泛存在于植物的花、果實(shí)、莖、葉和根器官的細(xì)胞液中，使其呈現(xiàn)由紅、紫紅到蘭等不同顏色。花色苷是類(lèi)黃酮——以黃酮核為基礎(chǔ)的一類(lèi)物質(zhì)中能呈現(xiàn)紅色的一族化合物。它由于其獨(dú)特的功能性，而被應(yīng)用于清除體內(nèi)自由基、增殖葉黃素、免疫調(diào)節(jié)[10]、抗腫瘤、抗癌[11]、抗衰老[12]、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和血小板凝集、預(yù)防糖尿病、減肥、保護(hù)視力等?；ㄉ兆鳛橐环N天然色素，安全、無(wú)毒，且對(duì)人體具有許多保健功能，已被應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。由于超聲波能提高細(xì)胞內(nèi)容物通過(guò)細(xì)胞膜的穿透力和傳輸能力，有效縮短提取時(shí)間，提高提取效率[1]，采用超聲波輔助法提取花色苷，其結(jié)構(gòu)破壞低，超聲時(shí)間少切效率高。為此，本實(shí)驗(yàn)研究了超聲波在黑果枸杞花色苷提取中應(yīng)用的可行性，考察了影響提取的主要因素，尋求最佳的提取工藝條件，為黑果枸杞和白刺的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料：柴達(dá)木黑果枸杞(干果)、柴達(dá)木白刺果(凍果)。

試劑：兒茶素對(duì)照品(AR)，甲醇、乙醇、丙酮、鹽酸、甲酸、香草醛：分析純，實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

1.2 儀器

分析天平，型號(hào)BT125D，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；超聲清洗儀，型號(hào)SB-25-12DT，寧波新生物科技股份有限公司生產(chǎn)；數(shù)顯水浴鍋，型號(hào)DK-8D，金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，型號(hào)TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花色苷提取方法

稱取2.00g黑果枸杞干果和白刺凍果，用0.01%酸化后的甲醇作為提取劑，按超聲波輔助提取設(shè)定的條件進(jìn)行提取。將提取液過(guò)濾，按上述條件再提取兩次，過(guò)濾合并濾液，定容備用。

1.3.2 花色苷檢測(cè)方法

1.3.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 精確稱取105℃干燥至恒重的兒茶素對(duì)照品0.0013g，置于10ml的容量瓶中用甲醇溶解，定容待用。分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7ml濃度為0.13mg/ml的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液至比色管中，分別加3ml 4%香草醛溶液和1.5ml HCl溶液，搖勻后室溫靜置15min。以蒸餾水作空白，在500nm處測(cè)吸光度A，以兒茶素含量(mg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定結(jié)果得回歸方程為y=2.1684x+0.0181.r=0.9989。

1.3.2.2花色苷含量的測(cè)定：將待測(cè)樣品按情況準(zhǔn)確稀釋一定的倍數(shù)，使溶液濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作，測(cè)吸光度，根據(jù)回歸方程算出黑果枸杞中花色苷含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

分別以提取溶劑、超聲時(shí)間、水浴溫度、提取時(shí)間、料液比及提取溶劑考察因素，以花色苷含量為指標(biāo)，選擇單一因素下花青素的最佳提取條件。

1.3.3.1 提取溶劑對(duì)花色苷含量的影響

稱取2.00g黑果枸杞干果和白刺凍果，分別以水、甲醇、乙醇、丙酮作為提取劑，在超聲時(shí)間2min、水浴溫度50℃，提取時(shí)間60min，料液比為1∶20，溶劑濃度60%的條件下進(jìn)行超聲輔助提取，提取3次，過(guò)濾合并提取液，定容于100ml容量瓶中。按花色苷含量的測(cè)定方法測(cè)吸光度A，計(jì)算花色苷含量。

1.3.3.2 超聲時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響

稱取2.00g黑果枸杞干果和白刺凍果，以甲醇作為提取劑，在水浴溫度50℃，提取時(shí)間60min，料液比為1∶20，溶劑濃度為60%的條件下，分別超聲2min、3min、4min、5min后水浴提取，提取3次，過(guò)濾合并提取液，定容于100ml容量瓶中。按花色苷含量的測(cè)定方法測(cè)吸光度A，計(jì)算花色苷含量。

1.3.3.3 水浴溫度對(duì)花色苷含量的影響

稱取2.00g黑果枸杞干果和白刺凍果，以甲醇作為提取劑，在超聲時(shí)間2min，提取時(shí)間60min，料液比分別為1∶20，溶劑濃度為60%的條件下，于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件下進(jìn)行水浴提取，提取3次，過(guò)濾合并提取液，定容于100ml容量瓶中。按花色苷含量的測(cè)定方法測(cè)吸光度A，計(jì)算花色苷含量。

1.3.3.4 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響

稱取2.00g黑果枸杞干果和白刺凍果，以甲醇作為提取劑，在超聲時(shí)間2min，在水浴溫度50℃，料液比分別為1∶20，溶劑濃度為60%的條件下，分別水浴提取30min、40min、50min、60min、70min，提取3次，過(guò)濾合并提取液，定容于100ml容量瓶中。按花色苷含量的測(cè)定方法測(cè)吸光度A，計(jì)算花色苷含量。

1.3.3.5 料液比對(duì)花色苷含量的影響

稱取2.00g黑果枸杞干果和白刺凍果，以甲醇作為提取劑，在超聲時(shí)間2min，在水浴溫度50℃，提取時(shí)間60min，溶劑濃度為60%的條件下，以料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30進(jìn)行水浴提取，提取3次，過(guò)濾合并提取液，定容于100ml容量瓶中。按花色苷含量的測(cè)定方法測(cè)吸光度A，計(jì)算花色苷含量。

1.3.3.6 提取溶劑濃度對(duì)花色苷含量的影響

稱取2.00g黑果枸杞干果和白刺凍果，以甲醇作為提取劑，在超聲時(shí)間2min，水浴溫度50℃，提取時(shí)間60min，料液比為1∶20的條件下，分別加入50%、55%、60%、65%、70%的甲醇溶液浴提取，提取3次，過(guò)濾合并提取液，定容于100ml容量瓶中。按花色苷含量的測(cè)定方法測(cè)吸光度A，計(jì)算花色苷含量。

1.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以超聲時(shí)間(A)、水浴溫度(B)、水浴時(shí)間(C)、料液比(D)、提取劑濃度(E)為考察因素，根據(jù)正交設(shè)計(jì)原理，以花青素提取率為指標(biāo)，進(jìn)行5因素4水平正交試驗(yàn)(表1)。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析每一個(gè)試驗(yàn)因素及水平的樣品均按照正交設(shè)計(jì)原理進(jìn)行，并且進(jìn)行花色苷含量測(cè)定。

表1 水平正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)研究

2.1.1 提取溶劑對(duì)花色苷含量的影響

如圖1所示，在黑果枸杞和白刺中分別加入水、甲醇、乙醇、丙酮四種不同的提取溶劑進(jìn)行提取時(shí)，花色苷在水中溶解不完全，顏色較淺，花色苷含量相對(duì)較低。而甲醇、乙醇、丙酮提取較完全，花色苷含量相對(duì)較高。其中，以甲醇作為提取劑，提取的花色苷含量最高。故選擇甲醇為提取溶劑。

圖1 提取溶劑對(duì)花色苷含量的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響

由圖2可知，黑果枸杞和白刺中花色苷含量隨超聲時(shí)間的增長(zhǎng)，呈現(xiàn)先增高后逐漸下降的趨勢(shì)，其中超聲時(shí)間為2min時(shí)，黑果枸杞和白刺中花色苷含量均最高。花色苷含量隨超聲時(shí)間的增加而逐漸下降，原因可能是植物細(xì)胞在超聲波作用下破裂后，花色苷溶出，由于超聲時(shí)間增長(zhǎng)，導(dǎo)致花色苷分解，含量下降。故選擇2min為最佳超聲時(shí)間。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響

2.1.3 水浴溫度對(duì)花色苷含量的影響

由圖3可知，黑果枸杞和白刺中花色苷含量隨水浴溫度的升高，呈現(xiàn)先逐漸上升再下降的趨勢(shì)，當(dāng)水浴溫度為60℃時(shí)，黑果枸杞和白刺中花色苷含量均最高。當(dāng)水浴溫度大于60℃時(shí)，花色苷含量開(kāi)始下降，原因可能是提取液中的花色苷在高溫下被氧化。故選擇水浴溫度60℃為黑果枸杞和白刺提取花色苷的最佳溫度。

圖3 水浴溫度對(duì)花色苷含量的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響

由圖4可知，黑果枸杞和白刺中花色苷含量隨提取時(shí)間的增長(zhǎng)，呈現(xiàn)明顯上升后逐漸下降的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為50min時(shí)，黑果枸杞和白刺中花色苷含量均最高。當(dāng)提取時(shí)間大于50min后，花色苷的含量變化不明顯，故選擇取時(shí)間50min為黑果枸杞和白刺提取花色苷的最佳提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響

2.1.5 料液比對(duì)花色苷含量的影響

由圖5可知，黑果枸杞和白刺中花色苷含量隨料液比的增加呈先緩慢上升再趨于平緩，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，黑果枸杞和白刺中花色苷含量均最高。當(dāng)料液比大于1∶20后，黑果枸杞和白刺中花色苷的含量上升緩慢，在考慮到生產(chǎn)成本后，選擇黑果枸杞和白刺提取花色苷的最佳料液比為1∶20。

圖5 料液比對(duì)花色苷含量的影響

2.1.6 提取溶劑濃度對(duì)花色苷含量的影響

由圖6可知，黑果枸杞和白刺中花色苷含量隨提取溶劑濃度的增大，呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢(shì)。當(dāng)提取溶劑濃度為60%時(shí)，黑果枸杞花色苷含量最高。當(dāng)提取溶劑濃度為65%時(shí)，白刺中花色苷含量最高。綜合考慮后，選擇黑果枸杞和白刺提取花色苷的最佳提取溶劑濃度為60%。

圖6 提取溶劑濃度對(duì)花色苷含量的影響

2.2 正交試驗(yàn)研究

從表2可以看出，通過(guò)正交試驗(yàn)從白刺中提取花色苷，極差大小變化為B>A>E>D>C。說(shuō)明水浴溫度的改變對(duì)花色苷的提取影響最大，其次是超聲時(shí)間，各因素最佳水平組合為B4A1E4D3C3。最佳提取工藝：水浴溫度70℃，超聲時(shí)間1min，提取劑濃度70%，料液比1∶25，水浴時(shí)間50min。

表2 白刺花色苷正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

從表3可以看出，用正交試驗(yàn)從黑果枸杞中提取花色苷，極差大小變化為A>B>D>C>E。說(shuō)明超聲時(shí)間的改變對(duì)花色苷的提取影響最大，其次是水浴溫度，各因素最佳水平組合為A4B4D4C4E3。最佳提取工藝：超聲時(shí)間4min，水浴溫度70℃，水浴時(shí)間60min，料液比1∶30，提取劑濃度65%。

表3 黑果枸杞花色苷正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)確定了超聲波輔助法提取黑果枸杞和白刺花色苷的工藝條件。其中，白刺花色苷提取的最佳工藝條件：水浴溫度70℃，超聲時(shí)間1min，提取劑濃度70%，料液比1∶25，水浴時(shí)間50min。黑果枸杞花色苷提取的最佳工藝條件：超聲時(shí)間4min，水浴溫度70℃，水浴時(shí)間60min，料液比1∶30，提取劑濃度65%。白刺中花色苷含量為0.313g/100g，黑果枸杞中花色苷的含量為1.309g/100g。由此可見(jiàn)，白刺和黑枸杞有很高的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值。

綜上所述，超聲波提取白刺和黑果枸杞中花色苷研究工藝可行，可得到含量較為豐富的花色苷，為白刺、黑果枸杞在精深加工產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面提供一定的技術(shù)支持和理論數(shù)據(jù)參考。后期將進(jìn)一步對(duì)白刺、黑果枸杞花色苷成分分析對(duì)比進(jìn)行研究分析，為白刺、黑果枸杞精深加工產(chǎn)業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。