李望豪，許鈺瀅，謝瑋軒，王墨羽，吳鳳娟，賴思松，葉杰輝，王榮波，魯國(guó)東1,，葉文雨1,

(1.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.植物與微生物相互作用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013)

甘蔗是全球范圍內(nèi)得到廣泛種植的作物，我國(guó)在甘蔗產(chǎn)業(yè)方面為世界第三，巴西位列第一[1-4]。以往對(duì)甘蔗栽培模式和分離產(chǎn)物研究較多，但對(duì)甘蔗根際土壤微生物與非根際土壤微生物的比較在文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道。通過(guò)對(duì)甘蔗在大自然中生長(zhǎng)的條件的探究和對(duì)其根際土壤微生物代謝能力的分析能有效提高我國(guó)甘蔗行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力，為甘蔗的合理種植，提高甘蔗的質(zhì)量、品質(zhì)和產(chǎn)量提供依據(jù)。

土壤是甘蔗生長(zhǎng)過(guò)程中吸收養(yǎng)分的主要來(lái)源，而土壤中的微生物代謝活性是土壤肥力的潛在指標(biāo)，它可以反映出土壤里面的微生物的功能及其多樣性[5]。Biolog-Eco平板包括6類共計(jì)31種碳源試驗(yàn)中它根據(jù)不同孔吸光值計(jì)算平均顏色變化率，通過(guò)平均顏色變化率來(lái)體現(xiàn)對(duì)碳源的利用，進(jìn)一步表現(xiàn)出根際微生物群落代謝活性的動(dòng)態(tài)變化[6]。因此Biolog-Eco技術(shù)對(duì)土壤微生物代謝及其功能多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析在大多數(shù)類似試驗(yàn)中得到了大家廣泛的應(yīng)用[7-9]。

本研究通過(guò)對(duì)漳州市龍文區(qū)朝陽(yáng)鎮(zhèn)甘蔗根際土壤微生物與非根際土壤微生物對(duì)不同碳源的利用，揭示了甘蔗根際微生物群落的功能多樣性同時(shí)為甘蔗產(chǎn)業(yè)化種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)供試甘蔗根際土與非根際土樣品采自漳州市龍文區(qū)朝陽(yáng)鎮(zhèn)。

1.2 土壤樣品的采集

采用五點(diǎn)取樣法在每塊地用土鉆采集0-20cm的根際土壤與非根基土壤樣品。將五個(gè)樣品混合為一個(gè)樣品用無(wú)菌袋收集，并將土樣置于4℃冰箱保存，1d內(nèi)進(jìn)行分析。

1.3 試驗(yàn)方法

采用Biology-ECO技術(shù)對(duì)甘蔗根際土壤微生物群落和非根際土壤微生物功能及代謝進(jìn)行多樣性分析，并選取培養(yǎng)168h的土壤稀釋培養(yǎng)液進(jìn)行土壤微生物碳源利用和主成分分析[10-12]。

稱取5g供試土壤加入到100ml無(wú)菌生理鹽水中，180rpm震蕩30min混勻。置于冰上冰浴2min，上清液與無(wú)菌生理鹽水混合到原來(lái)的千分之一。在Biology-ECO板A1、A5、A9三個(gè)孔中加入150ul生理鹽水，其余孔采用八通道移液器依次加入150ul處理液。25℃恒溫避光培養(yǎng)，每24h使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定590nm時(shí)的吸光度，共記錄8d。

該試驗(yàn)中土壤微生物的代謝活性是通過(guò)AWCD值來(lái)定量反映的[13-14]。其中，測(cè)得的Ci的值為第i個(gè)碳源孔的吸光值，R的值為對(duì)照孔的吸光值，Ci- R小于0的孔記為0，在本試驗(yàn)中n為生態(tài)板底物數(shù)量為31。

多樣性指數(shù)，用H來(lái)表示，可以得出物種的豐富度。

H=-∑Pi×lnPi

優(yōu)勢(shì)度指數(shù)，用D來(lái)表示，用于評(píng)估某一物種的優(yōu)勢(shì)度。

均勻度指數(shù)，用U來(lái)表示，用于代表物種群落均勻度，其中ni為第i孔的相對(duì)吸光值。

上式中，Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比率，Ci- R小于0的孔記為0。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 處理原始數(shù)據(jù)，主成分分析采用Origin 2021、SPSS 20.0進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 土壤微生物群落代謝活性的變化

AWCD可用來(lái)反應(yīng)根際與非根際微生物的代謝活性，AWCD與土壤微生物的密度以及微生物的活性成正相關(guān)。甘蔗根際土壤與非根際土壤(甘蔗對(duì)照組)的AWCD值在培養(yǎng)24-168h快速增加，均在168h后趨于穩(wěn)定(圖1)，因此選擇168h的吸光值作為計(jì)算微生物群落多樣性的指標(biāo)。甘蔗根際土壤AWCD值顯著高于非根際土壤，從圖1可以得出根際土壤微生物對(duì)碳源利用顯著高于非根際土壤。

圖1 甘蔗土壤微生物AWCD值隨時(shí)間的變化

2.2 土壤微生物對(duì)C源的利用

甘蔗根際土與非根際土壤微生物對(duì)6種碳源的利用能力存在差異，且利用能力隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖2)。與非根際土壤微生物相比，甘蔗根際土壤微生物對(duì)氨基酸類、胺類、多聚物類、酚酸類、羧酸類、糖類的代謝能力在168h分別顯著提高了112.37%、93.45%、160.47%、68.68%、145.26%、130.76%。72h前，非根際微生物對(duì)酚酸類的利用顯著大于甘蔗根際微生物，而72h后則呈相反趨勢(shì)。

圖2 甘蔗根際與非根際土壤(對(duì)照)微生物對(duì)碳源的代謝能力

2.3 土壤微生物代謝多樣性

通過(guò)培養(yǎng)一周后所得到的平均顏色變化率對(duì)甘蔗根際和非根際土壤微生物對(duì)碳源的利用進(jìn)行主成分分析。其中符合特征值大于1的主成分一共有五個(gè)。第一、二主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為57.7%和17.4%，本文取前兩個(gè)主成分進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)的探究并得出下面的結(jié)果。

從主成分的系數(shù)矩陣結(jié)果可以看出，集中在第1主成分上有25種決定PC1變異的碳源(相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值>0.50)。其中氨基酸類占20%：L-精氨酸(C1)、L-天門(mén)冬酰胺(C2)、L-苯丙氨酸(C3)、L-絲氨酸(C4)、L-蘇氨酸(C5)；胺類占8%：苯乙胺(C7)、腐胺(C8)；多聚物類占8%：吐溫40(C9)、吐溫80(C10)；酚酸類占4%：4-羥基苯甲酸(C14)；羧酸類占28%：丙酮酸甲酯(C15)、D-葡糖胺酸(C16)、D-半乳糖醛酸(C17)、γ-羥丁酸(C18)、衣康酸(C19)、α-丁酮酸(C20)、D-蘋(píng)果酸(C21)；糖類占32%：D-纖維二糖(C22)、β-甲基-D-葡萄糖苷(C24)、i-赤蘚糖醇(C26)、D-甘露醇(C27)、N-乙酰-D-葡萄糖氨(C28)、1-磷酸葡萄糖(C29)、D,L-α-磷酸甘油(C30)、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯(C31)。可見(jiàn)影響PC1主要為糖類。決定PC2變異的主要碳源有7種包括：氨基酸類2種：L-苯丙氨酸(C3)、甘氨酰-L-谷氨酸(C6)；多聚物類2種：α-環(huán)式糊精(C11)、肝糖(C12)；酚酸類1種：2-羥基苯甲酸(C13)；羧酸類1種：α-丁酮酸(C20)；糖類1種：D,L-α-磷酸甘油(C30)。 L-苯丙氨酸(C3)、α-丁酮酸(C20)、D,L-α-磷酸甘油(C30)對(duì)PC1和PC2貢獻(xiàn)系數(shù)都大于0.5。

2.4 土壤微生物多樣性比較分析

根據(jù)第7天的AWCD值(詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)第一幅圖)，計(jì)算出甘蔗根際土與非根際土的三個(gè)相關(guān)指數(shù)(表1)。表中數(shù)據(jù)顯示，甘蔗根際土壤三項(xiàng)指標(biāo)均略高于非根際土壤，表明甘蔗根際土壤微生物群落多樣性程度較高[9]。

圖3 31種碳源對(duì)PC1和PC2貢獻(xiàn)的特征向量系數(shù)

表1 土壤微生物功能多樣性指數(shù)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)主要以甘蔗根際土壤與非根際土壤為研究，通過(guò)Biology-ECO技術(shù)對(duì)甘蔗根際土壤微生物群落進(jìn)行了相關(guān)分析，得到如下結(jié)論：(1)AWCD值變化表明，甘蔗土壤微生物群落的碳源代謝能力和代謝功能都明顯強(qiáng)于非根際土壤。(2)甘蔗根際土壤微生物對(duì)6種碳源的利用強(qiáng)度均顯著高于非根際土壤。(3)PCA結(jié)果表明，甘氨酰-L-谷氨酸、α-環(huán)式糊精、肝糖、2-羥基苯甲酸等碳源甘蔗根際土壤微生物不能利用。在通過(guò)培養(yǎng)基培養(yǎng)法研究甘蔗根際土壤微生群落時(shí)，應(yīng)優(yōu)先考慮其不能利用的其它碳源。(4)Shannon 多樣性指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢(shì)度指數(shù)、Mclntosh 均勻度指數(shù)的大小變化順序均為甘蔗根際土大于非根際土。

甘蔗具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值且其根際微生物群落代謝功能會(huì)對(duì)其產(chǎn)量產(chǎn)生影響。本文通過(guò)比較甘蔗根際與非根際土壤的微生物群落多樣性，研究根際對(duì)土壤中的微生物可能產(chǎn)生的影響。運(yùn)用Biolog-Eco生態(tài)板技術(shù)研究土壤微生物區(qū)系代謝活性時(shí)，較高的AWCD值代表著土壤微生物代謝活性較高，反之則表明土壤微生物區(qū)系代謝活性較低[15-18]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果易知，甘蔗的根際土壤微生物各時(shí)段AWCD值很大一部分大于非根際土壤，說(shuō)明了根際土壤微生物的代謝活性和對(duì)各類碳源的利用都優(yōu)于非根際土壤微生物。

多樣性指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和均勻度指數(shù)等三個(gè)常用指數(shù)通常被用來(lái)反應(yīng)土壤微生物群落的多樣性，可以揭示土壤微生物種群構(gòu)造和能力的差別[19-20]。根據(jù)研究表明根際土壤微生物群落的各項(xiàng)指數(shù)均優(yōu)于非根際土壤。尤其是Mclntosh 均勻度指數(shù)明顯的高于非根際土壤，從以上數(shù)據(jù)可以得出甘蔗能促進(jìn)土壤微生物群落產(chǎn)生多種多樣的功能。

在進(jìn)行主成分對(duì)比分析時(shí)可以得出，根際土壤微生物可以利用氨基酸、胺類、多聚物類等作為碳源，且其對(duì)碳源的利用優(yōu)于非根際土壤，這可能是因?yàn)楦收嶂仓隁報(bào)w為土壤微生物群落提供了豐富的養(yǎng)分，進(jìn)而造成了對(duì)碳源利用的不同，應(yīng)進(jìn)一步用培養(yǎng)試驗(yàn)基培養(yǎng)法分離微生物來(lái)對(duì)猜想進(jìn)行驗(yàn)證。

在現(xiàn)有條件下，用Biolog-Eco生態(tài)板技術(shù)從碳源代謝的角度來(lái)討論根際微生物對(duì)土壤微生物的影響存在一定的局限性。在今后的試驗(yàn)中，應(yīng)進(jìn)一步深入分析。