徐鴻雁

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016)

鎘[Cd(II)]是一種常見(jiàn)的環(huán)境污染物，主要來(lái)自于采礦、燃煤、焚化垃圾、電子鍍鎘等人為因素[1]，它侵入土壤后經(jīng)生物循環(huán)進(jìn)一步進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)，破壞生物多樣性，對(duì)人體健康有害[2-3]。長(zhǎng)期受Cd污染的環(huán)境中，生存著一定數(shù)量對(duì)其具有較強(qiáng)耐受能力的微生物類群。而此類生物本身也會(huì)發(fā)生基因突變或自我調(diào)整代謝以適應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間的Cd脅迫環(huán)境。

羊肚菌(Morchella)，不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值[4]，對(duì)重金屬也有潛在的富集能力[5-8]，有研究發(fā)現(xiàn)野生羊肚菌Cd元素含量超出國(guó)家限定標(biāo)準(zhǔn)[9]。目前對(duì)于羊肚菌如何富集、耐受Cd的機(jī)理研究才剛剛起步，主要集中在子實(shí)體Cd含量測(cè)定[9]、Cd富集能力[10]、基因敲除[11]等方面，關(guān)于Cd脅迫下羊肚菌蛋白表達(dá)情況和響應(yīng)機(jī)制等研究鮮有報(bào)道。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)可對(duì)不同樣本同時(shí)進(jìn)行定量分析，已成為定量蛋白組學(xué)中的支撐技術(shù)之一，且越來(lái)越多被應(yīng)用到生物中，如水稻[12-13]、植物乳桿菌[14]和細(xì)菌[15]等抵抗重金屬脅迫機(jī)制的研究中。

本研究利用iTRAQ技術(shù)平臺(tái)定量分析Cd脅迫下羊肚菌蛋白質(zhì)差異表達(dá)變化，初步探究羊肚菌在Cd環(huán)境下的響應(yīng)機(jī)制，為探究真菌耐鎘機(jī)理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種來(lái)源

供試小海綿羊肚菌(M.spongiola)M12-10菌株由青海大學(xué)極端環(huán)境微生物研究室提供。菌株培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小海綿羊肚菌Cd處理菌絲的培養(yǎng)

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配制最終濃度為0mg/L、0.15mg/L、0.9mg/L、1.5mg/L的CdCl2培養(yǎng)基，對(duì)照(CK)組為無(wú)其它元素添加的PDA培養(yǎng)基。滅菌后于培養(yǎng)基中央接種一塊小海綿羊肚菌菌餅，在離接種塊附近斜插3塊無(wú)菌蓋玻片，放置于(20±1)℃黑暗恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d。

1.2.2 掃描電鏡觀察

Cd處理試驗(yàn)結(jié)束后，用2.5%戊二醛固定不同濃度Cd處理的羊肚菌菌絲，經(jīng)乙醇梯度脫水、置換、預(yù)冷、凍干、鍍金，采用掃描電子顯微鏡-X射線光譜儀觀察菌絲經(jīng)不同處理后形態(tài)變化。每處理做3個(gè)重復(fù)。

1.2.3iTRAQ蛋白定量實(shí)驗(yàn)

收集菌體樣品送至華大基因進(jìn)行iTRAQ蛋白定量分析，按步驟進(jìn)行菌絲粗蛋白提取、酶解、iTRAQ標(biāo)記、質(zhì)譜分析等流程[16]。

1.2.4 蛋白質(zhì)的鑒定和生物信息學(xué)分析

原始數(shù)據(jù)上傳至數(shù)據(jù)存儲(chǔ)平臺(tái)ProteomeXchange。定義差異倍數(shù)1.2倍及以上(即上調(diào)≥1.2和下調(diào)≤0.83)，且經(jīng)過(guò)顯著性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其Q-value值≤0.05的蛋白為顯著差異蛋白(DEPs)[17]。利用Gene Ontology、KEGG、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行功能注釋、生物通路信息分析，同時(shí)在WoLF PSORT軟件中對(duì)差異蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.5 蛋白表達(dá)的RT-qPCR驗(yàn)證

根據(jù)iTRAQ蛋白定量結(jié)果，篩選部分差異表達(dá)蛋白，對(duì)其編碼基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量，以驗(yàn)證iTRAQ蛋白定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。在線設(shè)計(jì)引物(表1)，18S rRNA為內(nèi)參。Cd處理第5天收集菌絲，真菌快速抽提總RNA、經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后在20μl反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)：引物(10μmol/L)0.4μl，cDNA (1μg/ml) 0.8μl，2×SG Fast qPCR Master Mix 10μl。反應(yīng)條件：95℃ 180s；95℃ 3s，各引物Tm值30s，40個(gè)循環(huán)[9]。數(shù)據(jù)使用2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算，每待測(cè)基因重復(fù)3次。

表1 qRT-PCR驗(yàn)證所選蛋白及對(duì)應(yīng)引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd對(duì)羊肚菌菌絲形態(tài)的研究

Cd脅迫處理的羊肚菌菌絲形態(tài)如圖1所示：對(duì)照CK無(wú)Cd添加時(shí)，菌絲表面光滑，菌絲扁平且直徑較寬；濃度在0.15mg/L時(shí)菌絲開(kāi)始出現(xiàn)褶皺且直徑變窄；濃度在0.9mg/L時(shí)菌絲出現(xiàn)扭曲且表面變的粗糙；濃度在1.5mg/L時(shí)菌絲出現(xiàn)明顯扭結(jié)、彎曲、折疊，菌絲表面褶皺凹陷情況增多。結(jié)果表明，Cd會(huì)破壞菌絲結(jié)構(gòu)和形態(tài)，從而抑制羊肚菌的生長(zhǎng)。

圖1 Cd(II)處理下小海綿羊肚菌掃描電鏡圖像

2.2 Cd對(duì)羊肚菌蛋白表達(dá)水平的研究

2.2.1 蛋白鑒定及定量分析

M12-10菌絲蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2所示，蛋白條帶清晰無(wú)降解，符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；菌體蛋白濃度及總量符合iTRAQ實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(表2)。在不同濃度Cd脅迫下，共檢測(cè)鑒定到3629個(gè)DEPs，其中144個(gè)蛋白對(duì)Cd處理呈現(xiàn)顯著差異性表達(dá)(圖3)。0.15mg/L Cd組中有17個(gè)DEPs表達(dá)上調(diào)，18個(gè)DEPs表達(dá)下調(diào)；0.90mg/L Cd處理組有29個(gè)DEPs表達(dá)上調(diào)，38個(gè)DEPs表達(dá)下調(diào)；1.50mg/L Cd處理組有25個(gè)DEPs上調(diào)表達(dá)，17個(gè)DEPs下調(diào)表達(dá)。值得注意的是，在三個(gè)Cd處理組的144個(gè)DEPs中，共有6個(gè)DEPs上下調(diào)趨勢(shì)一致。

圖2 總蛋白質(zhì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(左)及其SDS-PAGE電泳圖(右)注：泳道M為Marker；泳道1-4分別為樣品CK，Cd0.15，Cd0.9，Cd1.5。

表2 不同Cd環(huán)境下羊肚菌樣品中蛋白含量

圖3 鎘脅迫下羊肚菌菌絲差異表達(dá)蛋白

2.2.2 差異蛋白的GO功能富集

表3列出了小海綿羊肚菌在不同Cd濃度處理下DEPs含量最高的6個(gè)GO富集功能。0.15mg/L Cd處理組，DEPs顯著富集到碳水化合物分解代謝過(guò)程，涉及核糖體細(xì)胞組件、rRNA結(jié)合相關(guān)功能的蛋白變化最為顯著；0.9mg/L Cd處理下，DEPs顯著富集涉及小分子生物合成過(guò)程、硫化物代謝過(guò)程、硫胺素代謝及生物合成過(guò)程等，碳-氮鍵水解酶活性功能蛋白差異最顯著；1.5mg/L Cd處理下，DEPs主要作用于前體代謝物和能量的產(chǎn)生、藥物代謝過(guò)程、能量耦合質(zhì)子輸運(yùn)、ATP合成耦合質(zhì)子傳輸、細(xì)胞呼吸和ATP生物合成過(guò)程等。涉及ATP合酶、線粒體或其它相關(guān)的膜結(jié)構(gòu)、黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合功能蛋白差異最顯著。

2.2.3 差異蛋白的Pathway富集分析

0.15mg/L Cd處理組中DEPs主要參與果糖和甘露糖代謝、核糖體、甲烷代謝、磷酸戊糖途徑，其中參與甲烷代謝途徑的蛋白質(zhì)均上調(diào)表達(dá)；0.9mg/L Cd處理下DEPs主要參與代謝途徑、抗生素的合成、硫胺素代謝、氨基酸代謝等通路，參與硫胺素代謝和聚糖降解蛋白質(zhì)均上調(diào)表達(dá)；1.5mg/L Cd處理下DEPs主要參與代謝途徑，能量代謝、次生代謝產(chǎn)物的合成等通路，參與能量代謝如TCA循環(huán)、碳代謝等的蛋白質(zhì)均上調(diào)表達(dá)(圖4)。

圖4 差異表達(dá)蛋白Pathway注釋富集統(tǒng)計(jì)圖

2.2.4 差異蛋白亞細(xì)胞定位分析

不同Cd處理小海綿羊肚菌DEPs亞細(xì)胞定位分布如圖5所示：差異蛋白主要集中在胞質(zhì)溶膠、線粒體、細(xì)胞核和細(xì)胞外區(qū)域。具體來(lái)說(shuō)，0.15mg/L處理組中差異蛋白質(zhì)主要定位在細(xì)胞核中，0.90mg/L處理組中定位于胞質(zhì)溶膠、線粒體和細(xì)胞核的差異表達(dá)蛋白較多，1.5mg/L處理組差異蛋白在胞質(zhì)溶膠、線粒體和細(xì)胞外基質(zhì)中大量表達(dá)。

圖5 差異表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位統(tǒng)計(jì)圖注：extr-胞外基質(zhì)，plas-質(zhì)膜，cysk-細(xì)胞骨架，cyto-細(xì)胞溶質(zhì)，mito-線粒體，ER-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，nucl-細(xì)胞核，cytonucl-胞質(zhì)及核。

2.2.5 qRT-PCR驗(yàn)證

使用2-△△Ct法計(jì)算3種濃度鎘脅迫下亞硝酸還原酶、甘油醛 3 磷酸鹽脫氫酶、核糖蛋白、NADH依賴黃素氧化物酶、含TBP域蛋白等5個(gè)基因的表達(dá)水平(圖6)，其與蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)豐度變化表現(xiàn)一致，說(shuō)明蛋白組數(shù)據(jù)可信。

圖6 qRT-PCR相對(duì)定量分析結(jié)果注：nitrite reductase:亞硝酸還原酶；gapd:甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶；robo:核糖蛋白；NADP-fr：NADH依賴黃素氧化物酶；tbp:含TBP域蛋白

3 討論與結(jié)論

3.1 小海綿羊肚菌應(yīng)對(duì)Cd環(huán)境的關(guān)鍵蛋白

不同濃度Cd脅迫下小海綿羊肚菌有6種蛋白均表現(xiàn)出顯著差異，其中β-半乳糖苷酶、延伸因子1-α和細(xì)胞色素c氧化酶裝配蛋白樣蛋白cox15表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)表達(dá)，醛酮還原酶和兩個(gè)NAD(P)-結(jié)合蛋白則表現(xiàn)為持續(xù)下調(diào)表達(dá)。細(xì)胞色素c氧化酶被認(rèn)為是線粒體呼吸的限速步驟，其上調(diào)表達(dá)可能是一種補(bǔ)償機(jī)制，可以恢復(fù)線粒體活性的下降，從而限制Cd對(duì)細(xì)胞的損傷[18]。ROS是導(dǎo)致細(xì)胞損傷的原因之一，外源刺激會(huì)阻止胞內(nèi)正常的電子傳遞，進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體ROS的形成，而細(xì)胞色素c氧化酶作為電子傳遞鏈末端的酶復(fù)合體的重要組成部分，很容易被ROS攻擊導(dǎo)致電子傳遞中斷[19]。由此我們認(rèn)為，鎘脅迫下小海綿羊肚菌細(xì)胞色素c氧化酶蛋白的上調(diào)表達(dá)，有助于中和胞內(nèi)過(guò)量的ROS，減少線粒體內(nèi)呼吸鏈上的電子泄漏，防止鎘促進(jìn)的氧化應(yīng)激。類似由鎘脅迫引起的細(xì)胞色素c氧化酶I上調(diào)表達(dá)的情況在雙殼類和鯽魚(yú)腎臟細(xì)胞中也被發(fā)現(xiàn)[20-21]。延伸因子1-α可促進(jìn)多肽鏈延伸，參與蛋白翻譯、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等重要的細(xì)胞過(guò)程[22]。文獻(xiàn)指出，水稻延伸因子1-α基因的轉(zhuǎn)錄可被多種外源環(huán)境因子所誘導(dǎo)，而外源鎘和銅脅迫則容易誘導(dǎo)表達(dá)黃孢原毛平革菌菌絲體中的延伸因子1-α亞基[23-24]。本研究中，鎘脅迫下小海綿羊肚菌延伸因子1-α被三種濃度鎘持續(xù)性誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，表明延伸因子1-α在小海綿羊肚菌應(yīng)對(duì)外源鎘引起的蛋白轉(zhuǎn)錄中起到關(guān)鍵作用。β-半乳糖苷酶在很多生物中都有分布，且在生物體內(nèi)起著重要作用，是大腸桿菌在葡萄糖饑餓條件下乳糖代謝所必需的，也與細(xì)胞衰老相關(guān)[25-26]。衰老會(huì)使生物體β-半乳糖苷酶活性升高，而自由基積累及DNA損傷是細(xì)胞衰老最常見(jiàn)的誘因[27-28]。文獻(xiàn)指出，外源刺激導(dǎo)致胞內(nèi)積累過(guò)量的ROS，擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常氧化還原動(dòng)態(tài)平衡，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞自噬、凋亡或衰老[29]。有研究表明，外源氯化鎘促進(jìn)了裂殖酵母中β-半乳糖苷酶的合成[30]。一定濃度氯化鎘培養(yǎng)真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌，發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)突變菌株中都誘導(dǎo)了β-半乳糖苷酶的表達(dá)[31]。小海綿羊肚菌在鎘脅迫下，β-半乳糖苷酶持續(xù)性的上調(diào)表達(dá)，可能重點(diǎn)參與應(yīng)對(duì)鎘引起的胞內(nèi)自由基及ROS積累所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷甚至凋亡、衰老。醛酮還原酶是多元醇代謝通路途徑中限速酶之一，參與葡萄糖生成山梨醇的過(guò)程，此催化過(guò)程需要消耗NADPH，而GR催化生成GSH時(shí)也需消耗NADPH，AKR會(huì)與GR競(jìng)爭(zhēng)NADPH，導(dǎo)致減少GSH生成量，影響GSH清除自由基，進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激[32-34]。

本研究中，鎘脅迫下小海綿羊肚菌醛酮還原酶持續(xù)性下調(diào)表達(dá)，這不僅有利于降低與GST的NADPH競(jìng)爭(zhēng)，也可能通過(guò)限制多元醇代謝通路，進(jìn)一步減少葡萄糖的消耗，維持細(xì)胞正常代謝來(lái)應(yīng)對(duì)鎘的毒害。此外，多元醇代謝通路第二步是山梨醇脫氫酶將山梨醇氧化成對(duì)應(yīng)的果糖，這會(huì)致使氧化應(yīng)激的出現(xiàn)，因?yàn)榇诉^(guò)程會(huì)消耗NAD+，生成NADH，而NADH是生成ROS的重要底物[35]。在鎘脅迫下，小海綿羊肚菌菌絲體中的NAD(P)-結(jié)合蛋白持續(xù)下調(diào)，正是為減少ROS的生成，防止氧化損傷。

3.2 鎘脅迫下小海綿羊肚菌菌絲體蛋白調(diào)控機(jī)制

不同初始濃度Cd脅迫下小海綿羊肚菌菌絲比較蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，某些蛋白以及代謝通路的調(diào)控呈現(xiàn)出特殊的濃度依賴性，不同濃度處理組差異蛋白數(shù)量、代謝通路以及差異蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位都有所不同。首先，膜組分、氮利用以及果糖和甘露糖代謝等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的蛋白主要在0.15mg/L處理組差異上調(diào)表達(dá)，如肌動(dòng)蛋白A3b，微管蛋β鏈，抗增殖蛋白等；通過(guò)對(duì)0.15mg/L處理組的DEPs進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該組大多數(shù)顯著差異蛋白定位到細(xì)胞核(圖5)，表明在0.15mg/L低濃度Cd處理時(shí)細(xì)胞表面主要利用細(xì)胞膜來(lái)隔離環(huán)境中的Cd，同時(shí)也通過(guò)加速胞內(nèi)代謝等方式來(lái)保證細(xì)胞自身的生長(zhǎng)發(fā)育。這一階段細(xì)胞對(duì)外源Cd調(diào)控應(yīng)答可總結(jié)為“胞膜防御應(yīng)答模式”。其次，抗氧化活性、刺激應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能的蛋白在0.90mg/L處理組被顯著上調(diào)表達(dá)，其中包括硫氧還原蛋白、HMP合成酶以及glycoside hydrolase/deacetylase，F(xiàn)ructose-bisphosphate aldolase，Methyltransf_25等；亞細(xì)胞定位也表示0.90mg/L Cd脅迫下細(xì)胞內(nèi)溶膠、線粒體等的蛋白被差異表達(dá)(圖5)，這表明0.90mg/L Cd已經(jīng)超出了小海綿羊肚菌細(xì)胞膜對(duì)環(huán)境中Cd的清除能力，部分Cd已穿越細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)能合成刺激應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及抗氧化相關(guān)蛋白，應(yīng)對(duì)胞內(nèi)Cd導(dǎo)致的ROS積累以及脂質(zhì)過(guò)氧化等，同時(shí)細(xì)胞也能產(chǎn)生硫氧還蛋白與胞內(nèi)游離的Cd結(jié)合，改變其毒性價(jià)態(tài)，以達(dá)到緩解胞內(nèi)氧化損傷的目的。因此，這一階段細(xì)胞對(duì)外源Cd調(diào)控應(yīng)答可總結(jié)為“胞質(zhì)代謝應(yīng)答模式”。最后，1.5mg/L Cd脅迫處理組小海綿羊肚菌菌絲細(xì)胞內(nèi)參與能量代謝、次生代謝產(chǎn)物合成、損傷修復(fù)等生物學(xué)過(guò)程的蛋白被上調(diào)表達(dá)，與細(xì)胞成分及生物發(fā)生相關(guān)的蛋白均被下調(diào)表達(dá)，這表明1.5mg/L Cd脅迫環(huán)境下，大量Cd進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)積累了大量ROS，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)能(TCA循環(huán)、氧化磷酸化、葉綠素代謝等)促進(jìn)各類氧化還原反應(yīng)，并通過(guò)加速次生代謝產(chǎn)物如胞外多糖等的分泌，轉(zhuǎn)移胞內(nèi)過(guò)量的游離Cd。亞細(xì)胞定位也驗(yàn)證了次生代謝產(chǎn)物在1.5mg/L處理組的重要作用(圖5)。因此這一階段細(xì)胞對(duì)外源Cd調(diào)控應(yīng)答可總結(jié)為“外排修復(fù)應(yīng)答模式”。