周龍艷,李秀明,付世建

重慶師范大學(xué)進化生理與行為學(xué)實驗室, 重慶市動物生物學(xué)重點實驗室, 重慶 401331

近些年來,我國長江流域各種魚類種群數(shù)量下降較為嚴重,其原因主要包括洄游通道阻隔、產(chǎn)卵場消失和過度捕撈等[1]。此外,三峽大壩的修建導(dǎo)致水體生境發(fā)生巨大變化,魚類能否在生理和行為上適應(yīng)這些生境變化直接影響其種群動態(tài)以及增殖放流的效果[1—3]。先前的研究表明,巖原鯉(Procyprisrabaudi)、中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)和胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)等長江魚類的行為特征和生理表現(xiàn)對環(huán)境生態(tài)因子變化的響應(yīng)明顯不同[1—2, 4]。長江流域水生環(huán)境食物資源變動劇烈,相關(guān)研究鮮見報道。因此,本文旨在研究短期禁食脅迫下不同魚類的生理和行為響應(yīng)策略。

在食物資源不足時,生物體面臨降低生理功能、減少活動和維持一定活動水平和生理功能去覓食和避敵的兩難選擇[1,4—5]。魚類在長期進化歷程中為了適應(yīng)所處生境食物資源變動會形成不同的生理和行為調(diào)節(jié)策略[1,4—7]。當(dāng)魚類遭遇饑餓環(huán)境時,其應(yīng)激反應(yīng)能力、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和抗氧化能力十分重要[1, 3]。在維持應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和基礎(chǔ)耗能等方面,皮質(zhì)醇通常具有顯著的作用[1, 8],當(dāng)饑餓脅迫時,魚類一般會上調(diào)皮質(zhì)醇水平用以動員能量供給[1, 9],上調(diào)溶菌酶相關(guān)基因表達水平[10—13]；而隨著病原體侵入,魚體免疫球蛋白M(IgM)等特異性免疫指標(biāo)也可能明顯提高；此外,超氧化物歧化酶(SOD)是魚體抗氧化系統(tǒng)的主要酶類之一[14]。在脅迫條件下由于器官抗氧化物質(zhì)儲存減少和活性氧自由基增加[15],魚類SOD可能上調(diào)其基因表達水平[1,16—17],這將導(dǎo)致更多能量的消耗,假如沒有及時且足夠的食物資源補充,將會導(dǎo)致其免疫功能的損傷和已有能量的耗盡。當(dāng)遭遇饑餓脅迫時,魚體自身相關(guān)生理功能和行為調(diào)節(jié)能力對其生存適合度至關(guān)重要[1, 4—5]。

為了系統(tǒng)探討在短期禁食脅迫條件下魚類行為、免疫和生理等功能的響應(yīng)及其內(nèi)在聯(lián)系,本研究采用中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚為對象。目前這兩種魚類的野生種群數(shù)量稀少[18]。中華倒刺鲃是我國特有的一種鯉形目鯉科魚類,偏好急流且清澈水體生境；胭脂魚是一種鯉形目亞口魚科魚類,是該科分布在我國的唯一物種,也是我國的二級保護動物,偏好下層緩流水體生境[2,4,18]。中華倒刺鲃是以植物為主的雜食性魚類,而胭脂魚為底棲動物為主的雜食性魚類,兩種魚類在食物缺乏時可能表現(xiàn)出不同的行為和生理響應(yīng)。本研究測定了禁食1周和禁食2周兩種魚類血清SOD活性、皮質(zhì)醇水平、IgM水平和溶菌酶含量的變化。由于運動、免疫和機體的應(yīng)激反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)且均導(dǎo)致機體能量的大量消耗,本研究還測定了短期禁食后兩種魚類游泳能力和群體自發(fā)游泳行為。本研究旨在系統(tǒng)探討中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚對短期禁食的生理和行為響應(yīng)機制及其內(nèi)在聯(lián)系,以期為魚類養(yǎng)殖實踐和資源保護提供必要的參考資料。

1 材料與方法

1.1 馴養(yǎng)與短期禁食處理

本實驗所用的中華倒刺鲃與胭脂魚幼魚從重慶市永川區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖場購買獲得,每種實驗魚140尾,在室內(nèi)循環(huán)水凈化控溫養(yǎng)殖水槽中馴養(yǎng)2周,水體溫度控制在(25±1)℃,用商品飼料每天飽足投喂2次(09:30和17:00),攝食1h后清除糞便與剩余餌料[1]。用充分曝氣并控溫后的自來水作為養(yǎng)殖用水,養(yǎng)殖水體溶氧飽和度控制在90%以上,每天更換總體水量的20%[1]。馴養(yǎng)2周以后,將每種實驗魚隨機分成正常攝食1周對照組、禁食1周處理組、正常攝食2周對照組和禁食2周處理組,每組35尾(3個重復(fù),分別為12、12、11尾),并測量其初始體重和體長。所有實驗魚分別在處理1周或2周結(jié)束后禁食24h,隨后測定相關(guān)指標(biāo)[1]。

1.2 最大均加速游泳速度(Ucat)

本實驗采用Blazka式魚類游泳測定儀測定最大均加速游泳速度[1,3—4,19]。具體操作簡要介紹如下：將單尾實驗魚轉(zhuǎn)入儀器中適應(yīng)馴化 1 h,儀器中水流速度約為 6 cm/s。隨后,將儀器中的水流速度以0.167 cm/s2的恒定加速度持續(xù)增加,直至實驗魚力竭,此時的流速即為魚的Ucat值[1]。當(dāng)實驗魚無力前進游泳,并停留在儀器末端篩板20s以上為力竭狀態(tài)的評判標(biāo)準(zhǔn)。游泳速度用相對游泳速度(體長/秒,BL/s)表示[1]。每組實驗魚測定9尾。

1.3 集群行為

實驗魚集群行為在一個有機玻璃板組成的水槽中進行,水槽的長、寬和高分別為70cm、37.5cm和35cm,水體深度為6cm[1, 4—5]。用高清攝像頭(與監(jiān)測器相連)記錄其集群行為。用不透明白色紗布將水槽四周圍起來,減少外界干擾對實驗魚集群行為的影響[1]。每種實驗魚分別隨機選取20尾(5個重復(fù),每個重復(fù)4尾)。先將實驗魚放置于水槽中適應(yīng)20min,隨后拍攝20min視頻。用Idtracer軟件分析視頻,獲得個體間平均距離(IID)、運動時間比(PTM)和運動時的速度中值[1,4—5,20—21]。

1.4 皮質(zhì)醇

隨機選取兩種實驗魚各6尾,置于魚類麻醉專用藥(MS222)(0.1g/mL)中麻醉,斷尾取血,高速離心10min(3000r/min),取上清液備用[1]。各個指標(biāo)取樣和樣品準(zhǔn)備操作相同。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)原理和Cayman試劑盒以及酶標(biāo)儀測定皮質(zhì)醇水平[1]。

1.5 免疫球蛋白(IgM)

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)原理和南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒以及酶標(biāo)儀測定IgM水平[1]。

1.6 溶菌酶

采用紫外分光光度計(530nm波長)和南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測定溶菌酶含量[1]。公式如下[1]：

溶菌酶含量(μg/mL)=(測定透光度UT2-測定透光度UT0)/(標(biāo)準(zhǔn)透光度ST2-標(biāo)準(zhǔn)透光度ST0)×

稀釋倍數(shù)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度

(1)

1.7 超氧化物歧化酶(SOD)

采用紫外分光光度計(550nm波長)和南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測定SOD活力[1]。公式如下[1]：

SOD活力(U/mL)=(對照管吸光度-測定管吸光度)/對照管吸光度/50%×稀釋倍數(shù) (2)

1.8 統(tǒng)計分析

本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Excel(2003)和SPSS 17.0軟件。采用t-test對體重和體長差異進行分析。采用一般線性模型單變量的三因素協(xié)方差分析短期禁食、魚的種類和禁食時間對其他指標(biāo)的影響(除了游泳速度中值用體長作協(xié)變量以外,其它指標(biāo)用體重作協(xié)變量)。群體游泳以短期禁食、魚的種類和禁食時間為主因子,編號作為隨機變量進行線性混合模型統(tǒng)計。假如方差分析檢驗通過,用Duncan′s多重比較分析不同的短期禁食組之間、不同的禁食時間點以及不同的魚類之間的差異。以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE)表示數(shù)據(jù)值,P<0.05為顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 短期禁食對兩種實驗魚魚體大小的影響

攝食對照組中華倒刺鲃幼魚1周體長顯著增加3.76%,2周體長顯著增加6.74%(P<0.001),禁食組中華倒刺鲃幼魚體長與實驗前沒有顯著變化；攝食對照組胭脂魚幼魚1周體長增加3.47%(P=0.008),2周體長增加2.67%(P=0.094),禁食組胭脂魚幼魚體長與實驗前沒有顯著變化(P>0.05)(表1)。

表1 短期禁食處理對中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚魚體大小的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,N= 35)

攝食對照組中華倒刺鲃幼魚體重1周顯著增加7.86%(P=0.014),2周顯著增加12.12%(P<0.001),禁食組中華倒刺鲃幼魚體重1周降低4.05%(P=0.231),2周降低10.09%(P<0.001)；攝食對照組胭脂魚幼魚體重與實驗前相比沒有顯著性差異,禁食組胭脂魚幼魚1周體重降低3.33%(P=0.321),2周體重降低4.48%(P=0.233),但都與實驗前沒有顯著變化。

2.2 短期禁食對兩種實驗魚魚群自發(fā)游泳行為和運動能力的影響

胭脂魚幼魚的Ucat顯著低于中華倒刺鲃幼魚(P<0.001),不過短期禁食對兩種實驗魚的Ucat都沒有產(chǎn)生顯著性的影響(表2,圖1)。

表2 短期禁食、魚的種類和禁食時間對最大游泳速度、溶菌酶、免疫球蛋白、超氧化物歧化酶和皮質(zhì)醇的三因素協(xié)方差統(tǒng)計分析表

圖1 短期禁食對中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚群體自發(fā)游泳行為和運動能力的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,自發(fā)行為：N=5,Ucat：N=9)Fig.1 The effects of short-term fasting on variables of maximum acceleration swimming speed and spontaneous shoal behaviour in S. sinensis and M. asiaticus (Mean±SE, N=5 for spontaneous behaviour and N=9 for Ucat)a和b表示兩種實驗幼魚之間差異顯著, * 表示攝食對照組和禁食處理組實驗幼魚之間差異顯著

中華倒刺鲃幼魚的自發(fā)游泳速度中值總體上低于胭脂魚幼魚,但僅僅在2周對照組實驗魚之間存在顯著性差異(表3,圖1)。胭脂魚幼魚的PTM顯著低于中華倒刺鲃幼魚,但短期禁食處理對兩種實驗魚的PTM都沒有顯著性影響。胭脂魚幼魚的IID顯著短于中華倒刺鲃幼魚,且兩種實驗魚攝食對照組的IID都顯著小于禁食處理組(P<0.001)。

表3 短期禁食、魚的種類和禁食時間對游泳速度中值、個體間距離和運動時間比的線性混合模型統(tǒng)計分析表

2.3 短期禁食對兩種實驗魚免疫指標(biāo)和皮質(zhì)醇的影響

兩種實驗魚皮質(zhì)醇水平之間無顯著性差異,但是1—2周短期禁食對血清皮質(zhì)醇水平有顯著性的影響(P<0.001)(圖2)。兩種實驗魚短期禁食后皮質(zhì)醇水平整體上升,但胭脂魚幼魚上升幅度不及中華倒刺鲃幼魚(交互作用:P=0.009)。胭脂魚幼魚血清的IgM水平顯著低于中華倒刺鲃幼魚(P=0.005),1—2周短期禁食導(dǎo)致中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚的IgM水平都顯著性提高(P<0.001),并且胭脂魚IgM水平提高沒有中華倒刺鲃明顯(P=0.018)(圖2)。1—2周短期禁食對溶菌酶的影響在兩種實驗魚之間存在差異(P=0.004)：兩種實驗魚對照組之間沒有顯著性不同,1—2周短期禁食對中華倒刺鲃幼魚血漿溶菌酶水平的影響不顯著,但是使胭脂魚幼魚溶菌酶水平顯著提高；1—2周短期禁食組胭脂魚幼魚溶菌酶水平顯著低于中華倒刺鲃幼魚(圖2)。中華倒刺鲃幼魚的SOD水平顯著低于胭脂魚幼魚(P=0.009),中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚SOD水平?jīng)]有受到短期禁食處理的影響(圖2)。

圖2 短期禁食對中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚抗氧化和免疫指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,N=6)Fig.2 The effects of short-term fasting on antioxidant and immune variables of S. sinensis and M. asiaticus (Mean±SE,N=6)

3 討論

3.1 中華倒刺鲃和胭脂魚的種間差異

中華倒刺鲃和胭脂魚在行為特征和生理功能上差異明顯[1,4,11, 20]。中華倒刺鲃幼魚的游泳速度比胭脂魚幼魚高出10%—20%,PTM和IID都高出100%左右。由此表明,胭脂魚擁有更低的游泳能力和不太活躍的行為特點[1,2,6,11]。胭脂魚較差的游泳能力可能與其體背較高,游泳阻力相對比較大有關(guān)[1—3]。胭脂魚還表現(xiàn)出更低的IgM水平,IgM和皮質(zhì)醇對1—2周短期禁食脅迫的響應(yīng)不太明顯。由此表明,作為一種偏好緩流的魚類,胭脂魚生理功能可能并沒有維持在較高的基礎(chǔ)狀態(tài)[1,22]。即使在食物供給充足的情況下,胭脂魚生長相對緩慢,但是其體重在食物缺乏情況下?lián)p失較小[1]。不過,胭脂魚的SOD活性比中華倒刺鲃高。由此表明,相比之下胭脂魚幼魚生理功能側(cè)重對氧化自由基的處理。這可能與兩種魚類的生理特點、生存環(huán)境和生態(tài)習(xí)性差異有關(guān)[1,4, 11,20,23—24]。

3.2 中華倒刺鲃和胭脂魚對短期禁食的行為反應(yīng)和生理響應(yīng)

本研究發(fā)現(xiàn),短期禁食(1—2周)導(dǎo)致中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚的體重下降約4%—7%,但促使兩種魚類自發(fā)游泳時IID都增加,可能是因為其增加搜索食物等行為導(dǎo)致群體凝聚力的降低[1, 4—5,19—20]。中華倒刺鲃和胭脂魚的游泳能力(Ucat)和PTM在1—2周短期禁食后沒有顯著性變化,這種研究結(jié)果在以往的研究中也被發(fā)現(xiàn)[1, 4,20,25]。魚類在短期食物缺乏的條件下維持其游泳能力有利于覓食等生理功能的實現(xiàn),進而提高其生存適合度[1, 4—5]。此外,胭脂魚在短期禁食后其SOD酶活性并沒有顯著變化,甚至溶菌酶和IgM還有所增加。這可能有利于胭脂魚動員免疫和抗氧化功能維持其體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[1,9,26—29]。皮質(zhì)醇在機體能量動員方面起著重要的作用[30],1—2周短期禁食導(dǎo)致中華倒刺鲃和胭脂魚的皮質(zhì)醇水平都出現(xiàn)增加的趨勢,且胭脂魚的皮質(zhì)醇上升顯著低于中華倒刺鲃,由此表明胭脂魚在面臨短期食物不足時對能量的動員可能不如中華倒刺鲃[1]。這也可以從短期禁食導(dǎo)致胭脂魚IgM水平的上升顯著低于中華倒刺鲃的結(jié)果得到佐證[1,31—32]。本研究發(fā)現(xiàn),在1—2周短期禁食條件下胭脂魚幼魚溶菌酶含量明顯增加,這可能與其底棲生活環(huán)境中病原體比較多有關(guān)[1,33]。

禁食脅迫可能導(dǎo)致魚類溶菌酶含量、皮質(zhì)醇水平和SOD活性下降、不變或者上升[1,8, 10—12],這可能與魚類禁食時間長短和不同魚類應(yīng)激反應(yīng)、抗氧化功能和免疫水平的種間差異相關(guān)[1]。本研究發(fā)現(xiàn)中華倒刺鲃和胭脂魚幼魚應(yīng)對1—2周短期禁食脅迫時在生理響應(yīng)和行為反應(yīng)上種間差異明顯。這可能與兩種魚類之間基礎(chǔ)生理狀態(tài)和饑餓脅迫下應(yīng)激調(diào)節(jié)的差異相關(guān),進而可能導(dǎo)致中華倒刺鲃和胭脂魚在相同的環(huán)境因子變動條件下出現(xiàn)不同的種群數(shù)量變動[1, 11]。