龔濤 李雨慶 周學(xué)東

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院 成都 610041

齲病是最常見(jiàn)的口腔感染性疾病之一，具有發(fā)病率高，治療率低，再治療率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響人類口腔和全身健康[1-3]。第四次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查[4]結(jié)果顯示，中國(guó)居民整體患齲率普遍偏高，如35～44歲年齡組的恒牙患齲率為89.0%，55～64歲年齡組的恒牙患齲率為95.6%，65～74歲年齡組的恒牙患齲率高達(dá)98.0%。現(xiàn)代齲病病因?qū)W說(shuō)認(rèn)為，齲病是發(fā)生于牙體硬組織，由微生物代謝產(chǎn)酸所導(dǎo)致的慢性感染性疾病[5]。牙齒表面的微生物和細(xì)胞外基質(zhì)往往形成多種生物膜群落，正常情況下宿主與生物膜之間處于健康的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[6]。當(dāng)宿主長(zhǎng)期攝入高糖飲食時(shí)，微生物代謝可產(chǎn)生多種細(xì)胞外基質(zhì)和酸性代謝物，胞外基質(zhì)的產(chǎn)生可促進(jìn)生物膜的形成，同時(shí)生物膜內(nèi)微生物多樣性減少，而產(chǎn)酸和耐酸性微生物增加，即生物膜的微生態(tài)平衡被打破，導(dǎo)致生物膜與牙齒表面接觸部位局部pH降低，最終引發(fā)牙體硬組織脫礦[6-8]。

變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是主要致齲微生物之一，其致齲毒力包括產(chǎn)酸耐酸性、對(duì)牙面的黏附作用、合成細(xì)胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）和對(duì)環(huán)境應(yīng)激的適應(yīng)能力[9-10]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，S.mutans不僅能夠代謝碳水化合物（如蔗糖）產(chǎn)生有機(jī)酸致使牙齒脫礦，還能夠合成水不溶性胞外多糖。EPS不僅可作為微生物代謝的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也能為S.mutans及其他微生物的定植和集聚提供黏附位點(diǎn)，促進(jìn)牙菌斑生物膜的形成。研究[11-12]表明，S.mutans毒力因子的形成與其糖類轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)，而糖類的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝又受到多種因子的調(diào)控。因此，本文主要綜述S.mutans糖轉(zhuǎn)運(yùn)的研究進(jìn)展，尤其關(guān)注糖轉(zhuǎn)運(yùn)方式和調(diào)控糖轉(zhuǎn)運(yùn)的各種調(diào)節(jié)因子，以期為口腔中其他細(xì)菌糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)機(jī)制研究提供參考。

1 糖轉(zhuǎn)運(yùn)

糖類是細(xì)菌主要的碳源，細(xì)菌攝入后可用于糖酵解途徑產(chǎn)生腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），合成各種細(xì)胞組分（如肽聚糖、脂肪酸、核酸）以及細(xì)胞內(nèi)多糖（intercellular polysaccharide，IPS）。細(xì)菌攝入糖的類型因其種類不同而存在較大差異，如S.mutans可利用棉子糖作為碳源，而其他鏈球菌則不能[13]。S.mutans攝入糖的種類可大致分為單糖（葡萄糖、果糖和半乳糖），二糖（蔗糖、乳糖、麥芽糖和海藻糖），三糖（棉子糖）和氨基糖（葡萄糖胺和N-乙酰葡糖胺）等[11]。研究[11,14]表明，S.mutans轉(zhuǎn)運(yùn)糖的方式主要有2種：磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system，PTS）和ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。

1.1 PTS

PTS又稱為磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）依賴性糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system，PEP-PTS），是S.mutans攝入糖類最主要的方式。截止目前，已報(bào)道的PEP-PTS系統(tǒng)結(jié)構(gòu)基本相似，主要包含2個(gè)胞質(zhì)磷酸轉(zhuǎn)移酶：酶Ⅰ（enzymeⅠ，EⅠ）；組氨酸磷酸載體蛋白（histidinecontaining phosphocarrier protein，HPr）以及依賴于物種的數(shù)目可變的糖結(jié)合特異性酶Ⅱ（enzymeⅡ，EⅡ）復(fù)合物，包括EⅡA、EⅡB、EⅡC和EⅡD[15]。如在攝入葡萄糖時(shí)，葡萄糖先與EII特異性結(jié)合并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜內(nèi)，同時(shí)EⅠ磷酸化后再將磷酸基團(tuán)傳遞給HPr，形成的P-HPr隨即磷酸化葡萄糖形成葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，Glu-6P），最后Glu-6P進(jìn)入糖酵解途徑[11,15]。在S.mutansUA159中含有14種PTS，其中特異性EⅡ約15種，表明它可轉(zhuǎn)運(yùn)多種糖類滿足自身代謝需求并適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境[16-17]。

1.2 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)

相比PTS，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)糖類的特異性較低，但能夠轉(zhuǎn)運(yùn)多種不同類型的多糖[11]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)中均有ABC存在，其通過(guò)水解ATP釋放的能量來(lái)對(duì)底物進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。S.mutansUA159基因組注釋表明含有4種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[14]，而目前結(jié)構(gòu)相似且研究較為清楚的是：MsmEFGK和MalXFGK[18]。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域（圖1）：一個(gè)綁定多糖的膜外結(jié)合蛋白（MsmE/MalX），2個(gè)跨膜蛋白（MsmF/MalF和MsmG/MalG）和一個(gè)位于胞內(nèi)結(jié)合ATP的亞基（MsmK/MalK），即當(dāng)膜外蛋白MsmE結(jié)合多糖底物后并將其傳給跨膜通道蛋白MsmF和MsmG，同時(shí)將信號(hào)傳遞給膜內(nèi)蛋白MsmK使其水解ATP供能，促使底物進(jìn)入胞內(nèi)[18-19]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，MsmEFGK主要轉(zhuǎn)運(yùn)蜜二糖、棉子糖、水蘇糖、異麥芽糖和異麥芽三糖等，而MalXFGK主要轉(zhuǎn)運(yùn)麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖和麥芽七糖等?？傊?，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)擴(kuò)大了S.mutans攝入糖的范圍，提高自身的適應(yīng)能力。

圖1 PTS和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Fig 1 PTS and ABC transporter

2 調(diào)控糖轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制

2.1 轉(zhuǎn)錄激活子

S.mutansUA159菌株海藻糖操縱子中TreR作為轉(zhuǎn)錄激活子調(diào)控treA和treB表達(dá)以響應(yīng)對(duì)海藻糖的利用[20]。研究[20]還發(fā)現(xiàn)，TreR的缺失不僅影響氧耐受和酸耐受能力，同時(shí)也極大地降低變鏈素的產(chǎn)生，導(dǎo)致種間競(jìng)爭(zhēng)能力下降。此外，CelR也作為轉(zhuǎn)錄激活子調(diào)控S.mutans對(duì)纖維二糖的利用[21]；StsR失活引起多個(gè)PTS操縱子基因下調(diào)，導(dǎo)致糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力嚴(yán)重下降，并影響EPS合成和生物膜的形成[22]。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子可直接參與調(diào)控PTS轉(zhuǎn)運(yùn)糖的能力，同時(shí)也能影響其毒力因子的形成。

2.2 轉(zhuǎn)錄抑制子

S.mutansUA159菌株中NigR作為轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)合至啟動(dòng)子區(qū)域，與RNA聚合酶形成空間阻遏并阻止下游基因的轉(zhuǎn)錄，抑制代謝蔗糖形成生物膜的操縱子PTSBio的表達(dá)，進(jìn)而影響糖轉(zhuǎn)運(yùn)和生物膜形成[23]。研究[24-26]發(fā)現(xiàn)，分解代謝物控制蛋白（catabolite control protein A，CcpA）、FruR和EⅡMan都可抑制manLMN操縱子（主要轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖胺和N-乙酰葡糖胺）的表達(dá)；同時(shí)，CcpA和FruR也可阻遏fruRKI操縱子（主要轉(zhuǎn)運(yùn)果糖）的轉(zhuǎn)錄，而fruR和fruK的缺失可影響S.mutans碳水化合物代謝以及生物膜的形成[17]。以上研究結(jié)果表明，部分轉(zhuǎn)錄因子不僅可作為負(fù)調(diào)節(jié)子阻止糖類的轉(zhuǎn)運(yùn)，而且單個(gè)轉(zhuǎn)錄因子還能同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子轉(zhuǎn)錄，暗示著S.mutans擁有精密而又復(fù)雜的糖轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.3 雙組分系統(tǒng)

FruA是S.mutans果聚糖水解酶，可分解果聚糖為果糖被其利用，而果聚糖的存在又可激活fruA的表達(dá)[27]。研究[28]發(fā)現(xiàn)，在果糖存在的情況下，LevQRST雙組分系統(tǒng)響應(yīng)果糖并激活fruA和levDEFG（即PTS的EⅡlev組分）轉(zhuǎn)錄。一方面，大量表達(dá)的FruA將胞外的果聚糖分解為果糖，同時(shí)將轉(zhuǎn)運(yùn)更多的胞外果糖至細(xì)胞內(nèi)。另一方面，F(xiàn)ruA的積累促使EⅡlev和EⅡFru反饋調(diào)節(jié)fruA并抑制它的表達(dá)；同時(shí)，胞內(nèi)的果糖增加也會(huì)激活碳分解代謝物阻遏（carbon catabolite repression，CCR）系統(tǒng)去關(guān)閉fruA的轉(zhuǎn)錄。此外，果聚糖可作為S.mutans的胞外儲(chǔ)能多糖，當(dāng)缺乏速效碳源時(shí)可利用該途徑攝入果糖為細(xì)胞提供碳源，以應(yīng)對(duì)饑餓脅迫并提高環(huán)境適應(yīng)能力。

2.4 CCR

CCR是指微生物在混合碳源發(fā)酵時(shí)優(yōu)先利用速效碳源（通常為葡萄糖），且該碳源的代謝產(chǎn)物會(huì)抑制其他非速效碳源代謝相關(guān)的基因表達(dá)和蛋白活性，從而影響非速效碳源利用的現(xiàn)象[29-30]。在低GC含量（即鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶所占的比例）的革蘭陽(yáng)性菌中，CCR的關(guān)鍵調(diào)控因子為CcpA[29]。如S.mutans以葡萄糖等為速效碳源時(shí)，胞內(nèi)ATP和果糖-1,6-二磷酸（fructose-1,6-bisphosphate，F(xiàn)BP）含量升高激活HPrK/P的活性，將HPr絲氨酸殘基磷酸化形成P-(Ser)-HPr，隨即與轉(zhuǎn)錄因子CcpA形成復(fù)合物直接結(jié)合非速效碳源基因的代謝響應(yīng)位點(diǎn)分解代謝反應(yīng)元件（catabolite response elements，CRE），從而激活或阻遏非速效碳源基因的轉(zhuǎn)錄，然而CcpA的缺失并不會(huì)導(dǎo)致CCR功能完全喪失[31]。研究[32]發(fā)現(xiàn)，CcpA不僅調(diào)節(jié)S.mutans碳水化合物代謝以及毒力因子的表達(dá)，同時(shí)在其許多基因的啟動(dòng)子區(qū)域可檢測(cè)到大量的潛在CcpA結(jié)合位點(diǎn)cre，暗示CcpA還有可能調(diào)控其他生理功能。如CcpA可直接結(jié)合lrgAB和cidAB操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域，進(jìn)而調(diào)控葡萄糖攝取，細(xì)胞自溶，基因感受態(tài)，生物膜形成和應(yīng)激響應(yīng)等[33]。當(dāng)以葡萄糖、果糖或甘露醇作為單一碳源時(shí)，敲除CcpA雖然影響S.mutans的生長(zhǎng)，卻增強(qiáng)了其糖酵解能力、IPS的儲(chǔ)存和酸耐受能力[34]。然而，IPS的儲(chǔ)存在細(xì)菌長(zhǎng)久定植（或持留）和毒力因子形成方面具有重要作用[35]，進(jìn)一步表明CcpA可影響S.mutans碳源的利用和毒力因子的形成。此外，CcpA也可調(diào)節(jié)多種EⅡ滲透酶的表達(dá)來(lái)間接影響非速效糖攝入的能力[31,36]。因此，S.mutans以CCR這種方式快速且無(wú)縫地調(diào)節(jié)碳水化合物的攝取和代謝途徑，從而更加高效地響應(yīng)口腔內(nèi)不斷變化的復(fù)雜環(huán)境。

3 小結(jié)與展望

S.mutans糖類的攝入與其毒力因子的形成有著非常密切的聯(lián)系，其攝入糖類的方式主要包括PTS系統(tǒng)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。它們不僅可以運(yùn)輸和磷酸化碳水化合物，而且可以執(zhí)行與碳代謝有關(guān)的調(diào)節(jié)功能以及影響毒力因子的形成?？谇皇且粋€(gè)持續(xù)變化的復(fù)雜環(huán)境，S.mutans擁有多種轉(zhuǎn)運(yùn)糖類的方式，以維持新陳代謝和適應(yīng)多變復(fù)雜的環(huán)境。未來(lái)的工作將致力于糖轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制研究，尋找更多調(diào)控糖類轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子，以此作為抗齲靶點(diǎn)阻止糖類的轉(zhuǎn)運(yùn)并抑制毒力因子的形成，從而為齲病防治或治療提供新策略。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。