郝丙青，夏瑩瑩，葉 航，甘四明，馬錦林

（1.中國林業(yè)科學研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520；2.南京林業(yè)大學，江蘇 南京 210037；3.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院，廣西 南寧 530002）

香花油茶Camellia osmantha，是山茶科山茶屬短柱茶組的一個新物種[1]，具有生長快[2]、抗逆性強[3]、耐高溫[4]、抗病蟲害[5-6]等特性。此外，與陸川油茶Camellia vietnamensis、普通油茶Camellia oleifera相比，香花油茶葉片日灼癥狀明顯減少，且光飽和點最高[7]。香花油茶非常適宜在南亞熱帶低海拔丘陵地區(qū)生長，是南帶油茶種植區(qū)極有潛力的油用作物。

葉綠體是植物細胞中最重要、最關(guān)鍵的細胞器，是植物進行光合作用的重要場所。植物葉綠體中含有一套獨立的遺傳物質(zhì)，其分子量小，遺傳特性穩(wěn)定，且含有大量的遺傳信息[8]。密碼子由生物體中遺傳信息mRNA上的3個堿基組成，能夠?qū)⑦z傳信息翻譯成氨基酸，進而合成功能蛋白。自然界中存在20種氨基酸，除色氨酸和甲硫氨酸外，其余氨基酸至少含有2個以上的密碼子，也稱為同義密碼子（Synonymous coden）。然而，在同義密碼子中，不同物種對不同密碼子的使用頻率不同，即某些物種或基因在同義密碼子選擇上會存在一定的偏好性[9-10]。甚至，同一物種不同器官、組織、基因之間都存在著一定程度的密碼子偏好性，這種由密碼子偏好性造成的差異，一般會在高表達基因中被檢測到，同時也會對基因功能、蛋白質(zhì)表達等產(chǎn)生影響[11-13]。此外，依據(jù)不同物種的密碼子使用偏好性，可以提高蛋白表達效率和準確性[14-15]。目前，油茶密碼子偏好性的研究僅限于普通油茶[16]，發(fā)現(xiàn)其不僅受突變作用，更多受選擇的影響。而香花油茶密碼子偏好性的研究未見報道。因此，本研究通過測序獲得香花油茶的葉綠體全基因組序列，進而研究其密碼子偏好性，一方面為了反映香花油茶的進化規(guī)律及突變方式，研究其適應外界環(huán)境的分子機制；另一方面，通過分析最優(yōu)密碼子，為香花油茶基因表達載體的設計提供參考，進而提高葉綠體基因組中基因的表達量。

1 材料與方法

1.1 材 料

對香花油茶葉綠體基因組測序并提交到國家基因組科學數(shù)據(jù)中心（登錄號：GWHBAUE00000000），香花油茶植株材料位于廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院油茶種質(zhì)資源庫（22°55′51″N，108°20′03″E），為了提高密碼子偏好性分析的準確性，從現(xiàn)存的88條序列中剔除不足300 bp的短序列及重復序列，最終獲得53條序列用于密碼子偏好性分析。

1.2 方 法

1.2.1 密碼子組成分析

使 用CodonW 1.4.2 軟 件（http://codonw.sourceforge.net）篩選出CDS序列，分析其密碼子偏好性參數(shù)，包括有效密碼子數(shù)（Effective Number of Codons，ENC）、同義密碼子相對使用情況（Relative Synonymous Codon Usage，RSCU）、GC1、GC2、GC3、GC_all（GC1、GC2和GC3表示各密碼子第1位、第2位、第3位堿基上的GC含量，GC_all表示密碼子三堿基中GC的平均含量）。最后使用SPSS 21.0軟件進行各參數(shù)之間的顯著性分析。

1.2.2 中性繪圖分析

中性分析（Neutrality plots）是以GC12（GC12表示第1位和第2位堿基上的平均GC含量）為縱坐標，G3為橫坐標的繪圖分析。通過分析二者的相關(guān)性，判斷密碼子偏好性的影響因素，即當GC12與GC3為顯著性相關(guān)時，密碼子偏好性受突變的影響；當GC12與GC3之間相關(guān)性不顯著時，密碼子偏好性受選擇的影響[17]。

1.2.3 ENC-plot分析

ENC（Effective Number Codon，ENC），是評價基因序列中密碼子偏好性中最具有參考價值的參數(shù)。通常，高表達基因的密碼子偏好性強，其ENC值較小，低表達基因則含有較多種類的稀有密碼子，其ENC值較大。所以，可以通過比較ENC值來確定內(nèi)源基因表達量的相對高低。本文中利用Python3.7軟件進行ENC-plot分析，以其ENC期望值為縱坐標，GC3為橫坐標，繪制標準曲線。當散點分布在標準曲線上或其附近時，表明該基因位點更多受突變的影響；當散點距離標準曲線較遠時，表明該基因位點受自然選擇的影響為主。

ENC=2+GC3+29/[(GC3)2+(1-GC3)2]。

式中：GC3為密碼子第三堿基的GC含量[8]。

1.2.4 PR2-plot偏好性分析

PR2-plot偏好性分析（PR2-bias plot analysis）是針對具有4種密碼子編碼的氨基酸，對其密碼子第3位堿基上A、U、C、G的組成情況進行分析[18]，以A3/(A3+U3)|4和G3/(G3+C3)|4的值進行繪圖。其中，“|4”表示具有4種密碼子編碼的氨基酸，分別為丙氨酸（GCA、GCC、GCG、GCU）、精氨酸（CGA、CGU、CGG、CGC）、甘氨酸（GGA、GGC、GGG、GGU）、亮氨酸（CUA、CUU、CUG、CUC）、脯氨酸（CCA、CCC、CCG、CCU）、絲 氨 酸（UCA、UCU、UCG、UCC）、蘇 氨 酸（ACA、ACC、ACG、ACU）和纈氨酸（GUA、GUC、GUG、GUU）。其中，PR2-plot圖的中心點為A=U，C=G，以該點發(fā)出的矢量表示堿基偏移的程度和方向。

1.2.5 最優(yōu)密碼子分析

本文中采用ΔRSCU法預測最優(yōu)密碼子[19]。對前期篩選出的88條基因序列的ENC值從小到大進行排序，排序結(jié)果的兩端各選出10%的序列，建設高、低表達的基因庫，然后計算高低表達基因庫中相對應的RSCU值和ΔRSCU，選取出ΔRSCU＞0.08的密碼子作為高表達密碼子。然后選取高表達密碼子和高頻密碼子的公共部分，最后確定最優(yōu)密碼子[20-21]。

式中：xij是編碼第i個氨基酸的第j個密碼子出現(xiàn)次數(shù)；ni是編碼第i個氨基酸的同義密碼子數(shù)量[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 香花油茶葉綠體基因組同義密碼子相對實用度分析

各氨基酸RSCU值分析結(jié)果（表1）顯示，RSCU值為1的密碼子數(shù)目為2個，即甲硫氨酸和色氨酸，該兩個氨基酸的密碼子使用沒有偏好性。RSCU＞1的密碼子數(shù)目共有31個，其中以U結(jié)尾的有16個，以A結(jié)尾的有12個，以G結(jié)尾的有3個，這說明以U或A結(jié)尾的密碼子是香花油茶葉綠體基因組較為偏愛的密碼子，以G或C結(jié)尾的則為非偏愛密碼子。

表1 香花油茶葉綠體基因組中各氨基酸的RSCU分析?Table 1 RSCU analysis of amino acids in the chloroplast genome of C.osmantha

2.2 香花油茶葉綠體基因組密碼子偏性

香花油茶葉綠體基因組中所有CDS中不同位置的GC含量結(jié)果（表2）顯示，所有CDS密碼子的平均GC含量為37.85%，且GC1(45.87%)＞GC2(39.67%)＞GC3(28.03%)，密碼子3個位置上堿基的GC含量并非均勻分布，香花油茶中CDS的GC1明顯大于GC2、GC3。香花油茶中，ENC值在24.1～61.0之間，平均值為46.23，香花油茶的ENC范圍明顯大于普通油茶的范圍（35.23～56.67）。

表2 香花油茶葉綠體基因組中各CDS序列密碼子不同位置GC含量及ENC值?Table 2 GC content and ENC value at different codon positions in each CDS sequence of C.osmantha chloroplast genome

2.3 偏性主要受到選擇作用的影響

2.3.1 相關(guān)性分析及中性繪圖分析

密碼子各位置GC含量與ENC值的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ENC與GC指標均不顯著相關(guān)，GC1與GC2呈極顯著性相關(guān)（P=0.005 5），GC_all與GC1、GC2和GC3呈極顯著相關(guān)（表3）。

表3 密碼子各位置GC含量和ENC值的相關(guān)性分析?Table 3 Correlation analysis of GC content and ENC value at each codon position

研究（圖1）表明，GC12的取值在0.310～0.555之間，GC3的取值范圍在0.17～0.56之間，GC12和GC3的相關(guān)系數(shù)為0.061 1，回歸系數(shù)為0.121 62，二者相關(guān)性不顯著，因此推測香花油茶葉綠體全基因組序列中密碼子的偏好性受選擇影響。

圖1 香花油茶葉綠體基因組中性繪圖Fig.1 Neutral plotting of the chloroplast genome of C.osmantha

2.3.2 ENC-plot分析

有研究證明，在ENC有效密碼子繪圖分布中，標準曲線上的密碼子使用偏好性不受自然選擇壓力的影響，而分布在標準曲線以外的密碼子則受自然選擇壓力或突變選擇壓力或其他因素影響[23]。本研究結(jié)果（圖2）顯示，部分基因位于標準曲線上或其附近，說明該部分基因位點的實際ENC值與理論ENC值基本一致，說明該部分基因的密碼子偏好不受自然選擇壓力的影響；部分基因距離標準曲線較遠，說明該部分基因位點的實際ENC值與理論ENC值相差較遠，則該部分基因的密碼子偏好性受自然選擇的影響更大。

圖2 香花油茶葉綠體基因組的ENC-plot分析Fig.2 ENC-plot analysis of the chloroplast genome of C.osmantha

此外也有研究發(fā)現(xiàn)，如果同義密碼子第3位堿基的GC（GC3s）值分布較廣，則表明密碼子使用偏好性受突變壓力的影響，因為相同的氨基酸可以由不同的密碼子所編碼；而如果GC3s值分布在較小的范圍內(nèi)，表示密碼子使用偏好性受自然選擇壓力的影響[24]。本研究中GC3s值分布在0.17～0.56之間（圖2），表明香花油茶葉綠體基因組密碼子偏好性受突變的影響。

當4種堿基（G、C、A、U）呈現(xiàn)均衡分布，密碼子偏好性不受突變和自然選擇的影響[25]。圖3顯示，A、U、G、C在4個區(qū)域中的分布是不均勻的，其中右下方位置中的個數(shù)較多，說明U的使用頻率高于A，G的使用頻率高于C，研究結(jié)果與芍藥Paeonia lactiflora[26]相一致。此外一般認為G和C（或者A和U）成比例地分布在密碼子第3位堿基上，則表明該物種的密碼子使用偏好性受突變壓力影響；如果G和C（或者A和U）不成比例地分布在密碼子第3位堿基上，則表明密碼子使用偏好性受自然選擇壓力影響[24]。因此推測自然選擇是影響香花油茶葉綠體基因組序列中密碼子偏好性的重要因素。

圖3 PR2-plot繪圖分析Fig.3 PR2-plot analysis of the chloroplast genome of C.osmantha

2.4 最優(yōu)密碼子分析

根據(jù)香花油茶葉綠體基因組中61個基因序列的ENC值大小進行排序，從排序結(jié)果的兩端各取10%的基因作為高、低表達的基因庫。然后計算兩個基因庫中密碼子的RSCU和ΔRSCU值，結(jié)果（表4）顯示，確定了22個密碼子為香花油茶葉綠體基因組的高表達密碼子。結(jié)合22個高表達密碼子和表1中RSCU＞1的31個高頻密碼子，選取二者的公共部分，最后確定了5個香花油茶葉綠體基因組最優(yōu)密碼子，分別為GAU、GGU、UUG、CCU、AGA。

表4 香花油茶葉綠體基因組序列最優(yōu)密碼子分析?Table 4 Optimal codons analysis of the chloroplast genome of C.osmantha

續(xù)表4Continuation of table 4

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)香花油茶葉綠體基因組中密碼子第3位堿基多以A或U結(jié)尾，這一結(jié)果與普通油茶[16]、山楂[27]、西南樺[28]、棗[29]、芍藥[26]、二穗短柄草[30]、杧果[31]、杜仲[32]等的研究結(jié)果相一致，表明植物葉綠體基因組中密碼子上的第3堿基可能具有相似的使用模式。同時發(fā)現(xiàn)GC3的含量最低，這也迎合了植物葉綠體基因組密碼子第3位堿基多以A、U結(jié)尾的結(jié)論。此外，GC1、GC2和GC3之間相關(guān)性不顯著，這與香花枇杷[33]、陸地棉[34]、糜子[35]等的研究結(jié)果相一致。

本研究中發(fā)現(xiàn)香花油茶葉綠體基因組中存在5個最優(yōu)密碼子，分別為GAU、GGU、UUG、CCU、AGA，其中3個以U結(jié)尾，1個以A結(jié)尾，1個以G結(jié)尾。一般認為富含AU堿基的序列中，最優(yōu)密碼子也同樣富含AU，而富含GC堿基的序列中，最優(yōu)密碼子也同樣富含GC[36]，本研究結(jié)果也驗證了這一結(jié)論。

3.2 討 論

前人研究表明，在正選擇和突變壓力的作用下會形成大量的最優(yōu)密碼子，相反，在純化選擇和突變壓力作用下只會導致少量最優(yōu)密碼子的形成[35]。本研究香花油茶葉綠體基因組中僅鑒定出5個最優(yōu)密碼子。因此推測，香花油茶葉綠體基因組中存在較少最優(yōu)密碼子的原因可能是由于該物種在進化過程中受到純化選擇壓力造成的。

本研究采用生物信息學方法分析了香花油茶葉綠體全基因組的密碼子偏好性，并鑒定出5個最優(yōu)密碼子，有利于進一步研究山茶屬植物的進化機制，為香花油茶的分子育種提供理論基礎(chǔ)。目前，由于香花油茶全基因組序列未知，其分子生物學的研究范圍存在很大的局限性。在后續(xù)的工作中，將在葉綠體全基因組水平和轉(zhuǎn)錄組水平分析控制某一重要性狀基因在山茶屬植物之間的偏好性。