王正和 馮勇軍 吳李仲 吳祥基

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）起源于鼻咽上皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，惡性化程度高[1-2]。鑒定潛在的生物標(biāo)志物對(duì)其診治至關(guān)重要，表觀遺傳學(xué)改變已被報(bào)道為惡性腫瘤中重要的致癌機(jī)制之一，在NPC發(fā)展的早期階段即能檢測(cè)到某些抑癌基因啟動(dòng)子過(guò)度甲基化[3]。來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的循環(huán)游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）具有腫瘤特性，為NPC 的早期診斷提供了有價(jià)值的信息。在既往的研究中，Zhao 等[4]利用甲基化捕獲測(cè)序和cDNA 微陣列技術(shù)獲得NPC 組織全基因組甲基化譜，提供了關(guān)于癌癥特異性異常甲基化的有用信息。其中RAS 樣雌激素調(diào)節(jié)生長(zhǎng)抑制劑（RAS-like estrogen-regulated growth-inhibitor，RERG）、鋅脂蛋白（zinc finger protein 671，ZNF671）編碼基因是NPC 中常見(jiàn)甲基化的主要腫瘤抑制基因[5-6]。目前尚不清楚這些基因的甲基化狀態(tài)是否可用于早期NPC 的診斷，因此本研究檢測(cè)了RERG 和ZNF671在血漿cfDNA及腫瘤組織中的甲基化情況，以評(píng)估其作為潛在的NPC 診斷生物標(biāo)志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2020年2月至2021年3月瓊海市人民醫(yī)院經(jīng)病理診斷且未治療的NPC 患者106 例（NPC 組），男性66 例，女性40 例，年齡22～75 歲，平均年齡（52.11±12.28）歲。臨床分期I 期25 例，Ⅱ期81 例。其中101 例患者為非角化型癌。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）符合NPC 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，并經(jīng)活檢病理學(xué)檢查確診；2）初治患者，活檢前未接受過(guò)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并其他部位惡性腫瘤、嚴(yán)重心、肺、腎、肝嚴(yán)重功能障礙者；2）入組前1 個(gè)月內(nèi)有大型手術(shù)史或嚴(yán)重創(chuàng)傷者。對(duì)照組分為兩組：1）正常對(duì)照組：本院進(jìn)行體格檢查的150 例健康志愿者［男性91 例，女性59 例，年齡18～79 歲，平均年齡（51.21±13.10）歲］；2）良性對(duì)照組：100 例經(jīng)活檢病理診斷為鼻咽部慢性黏膜炎的患者［男性60 例，女性40 例，年齡18～73 歲，平均年齡（51.44±12.89）歲］，排除惡性腫瘤、其他炎癥相關(guān)疾病和家庭腫瘤疾病史者。3 組受試者年齡、性別、居住地、吸煙史等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。本研究為前瞻性隊(duì)列觀察研究，研究方案以及其中所涉及到的組織、血液樣本、患者病歷資料的使用資質(zhì)均通過(guò)了本院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)：2020012），研究中的操作均符合操作規(guī)范，所有受檢者均提供書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 樣本獲取 血液樣本：NPC 組、良性對(duì)照組患者于手術(shù)當(dāng)天以及正常對(duì)照組在入組時(shí)采集清晨空腹外周靜脈血5 mL，均置于乙二胺四乙酸抗凝管中，1 600 r/min，10 min，離心2 次，分離留取血漿，置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存待測(cè)。組織樣本：將手術(shù)切除的NPC 組織使用生理鹽水清洗，置入液氮中速凍。1 h 后儲(chǔ)存于-80℃環(huán)境中保存，剩余樣本使用福爾馬林固定、石蠟包埋，制成4 μm 的連續(xù)切片，用于病理檢查或免疫組織化學(xué)分析。

1.2.2 血漿cfDNA 及組織DNA 提取使用QIAamp DNA Blood Mini Kit（德國(guó)Qiagen 公司）試劑盒提取血漿cfDNA。用2100 型生物分析儀系統(tǒng)與高靈敏度DNA 試劑盒分析血漿cfDNA 濃度，采用75～250 bp 血漿cfDNA 進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)；取出-80℃冰箱中的組織樣本，根據(jù)DNeasy Tissue Kit 試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）的操作說(shuō)明提取DNA。使用 Epi-Tect Bisulfite Kit 試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）將上述組織DNA 及血漿cfDNA 使用甲基化敏感和（或）甲基化依賴(lài)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理分離。

1.2.3 甲基化特異性PCR（methylation specific PCR，MSP） 使用組織DNA（250 ng）或血漿cfDNA 洗脫液（45 μL）分析6 個(gè)基因，其中包括4 個(gè)候選基因、2個(gè)質(zhì)控基因。同時(shí)建立SEC、DEC 限制性內(nèi)切酶酶切效率測(cè)試系統(tǒng)，應(yīng)用處理的DNA 作為PCR 擴(kuò)增模板，使用PyroMark PCR 試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）進(jìn)行。在NCBI 基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲取RERG、ZNF671 基因序列，采用MethPrimer 軟件設(shè)計(jì)MSP 引物，RERGFor：5’-GGAGTTTGGAGGTTTGGAAAT-3’，RERGRev：5’-CAAAAACAAATACCAATAACCC-3’；ZNF 671-For：5’-GAATTTAGGTTAGGGATAGTTTGAT-3’，ZNF671-Rev：5’-CCAAAAAAAAAATATTTCAATAC C-3’。擴(kuò)增熱循環(huán)步驟：95℃初始變性10 min；95℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。每個(gè)樣本平均進(jìn)行3 次平行PCR 檢測(cè)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳分離基因條帶，焦磷酸測(cè)序使用PyroMark Assay Design Software 2.0（德國(guó)Qiagen 公司）進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以χ2檢驗(yàn)，年齡等正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析；基因甲基化程度不符合正態(tài)分布，以M50（四分位值）表示，進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。采用Kappa 一致性檢驗(yàn)分析NPC 組患者血漿cfDNA 與組織中RERG、ZNF671 基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的相關(guān)性。使用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估血漿cf-DNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)對(duì)NPC 早期診斷的價(jià)值。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組受試者血漿cfDNA 中RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)比較

經(jīng)MSP 法檢測(cè)，NPC 組患者的血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化率及甲基化程度均顯著高于良性及正常對(duì)照組受試者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表1，圖1）。

表1 3 組受試者血漿cfDNA 中RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)分析 例（%）

2.2 NPC 組患者血漿cfDNA 與組織中RERG、ZNF671 基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的相關(guān)性分析

NPC 組患者的組織DNA 與血漿cfDNA RERG啟動(dòng)子甲基化率（45.28%vs.38.68%）檢驗(yàn)的Kappa值為0.788（P＜0.001），而ZNF671 啟動(dòng)子甲基化率（55.66%vs.48.11%）檢驗(yàn)的Kappa 值為0.791（P＜0.001）。組織與血漿cfDNARERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化率檢驗(yàn)結(jié)果的Kappa 值為0.6～0.85，認(rèn)為一致性較好。

2.3 NPC 組患者血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系

T 分期為Ⅱ期的NPC 組患者RERG 和ZNF671基因啟動(dòng)子甲基化率更高（P＜0.05）；同時(shí)艾巴氏病毒（Epstein-Barr virus，EBV）衣殼抗原（viral capsid antigen，VCA）-IgA 為1∶80、EA-IgA 為≥1∶40、EBV DNA≥121.90 copy/mL 的NPC 組患者RERG 啟動(dòng)子甲基化率也較高（P＜0.05，表2）。

表2 NPC 組患者血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系 （續(xù)表2）

表2 NPC 組患者血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.4 ROC 曲線分析血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化程度對(duì)NPC 的早期診斷價(jià)值

血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)聯(lián)合診斷NPC 的曲線下面積為 0.981（95%CI：0.971～0.992 ），顯著高于常規(guī)腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）單獨(dú)診斷的AUC（Z=-3.995，P=0.003，表3，圖2）。

表3 血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化程度對(duì)NPC 的診斷價(jià)值

3 討論

NPC 早期無(wú)明顯臨床癥狀，致使大部分新診斷患者已發(fā)展至局部晚期或存在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，早期診斷難度較大[8-9]?；赯hao 等[4]研究，本研究通過(guò)MSP 法 檢 測(cè) 了cfDNA 中2 個(gè) 候 選 基 因（RERG、ZNF671）以及組織DNA 的甲基化率，以評(píng)估其作為NPC 篩查的前瞻性生物標(biāo)記物，結(jié)果顯示血漿cf-DNA 中RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化率顯著升高，表明這些候選基因有助于NPC 的早期診斷。

血漿cfDNA 也被稱(chēng)作“液體活檢”，廣泛存在于血液、尿液、糞便及多種體液中，細(xì)胞凋亡、壞死或主動(dòng)分泌都可釋放血漿cfDNA，并攜帶來(lái)自腫瘤源細(xì)胞的DNA 甲基化、基因組變異等信息。血漿cfDNA在癌癥疾病進(jìn)展階段具有早發(fā)性、特異性，結(jié)合DNA甲基化等表觀遺傳改變的分析可能實(shí)現(xiàn)對(duì)于癌癥的早期診斷[10-12]；相較于組織活檢更為便捷、經(jīng)濟(jì)高效，同時(shí)屬于微創(chuàng)檢測(cè)，更便于對(duì)癌癥患者進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本研究中NPC 組患者的組織DNA 與血漿cfDNA RERG/ZNF671 啟動(dòng)子甲基化率檢驗(yàn)的Kappa 值均在0.6～0.85，檢驗(yàn)結(jié)果一致性較好，但血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化率均小于組織，可能與血漿cfDNA 不僅來(lái)自NPC 細(xì)胞，還來(lái)自正常細(xì)胞有關(guān)。

RERG 是多種致癌途徑的抑制因子，其于2001年通過(guò)微陣列分析首次被鑒別。RERG 在乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，可使腎素血管緊張素系統(tǒng)/絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路失活，進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，然而當(dāng)RERG 在乳腺癌組織中表達(dá)降低時(shí)，往往與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[13]。還有學(xué)者認(rèn)為RERG 高表達(dá)與惡性胸膜間皮瘤女性術(shù)后獲得更長(zhǎng)的生存時(shí)間相關(guān)[14]，與細(xì)胞周期和整聯(lián)蛋白相關(guān)的幾個(gè)通路被下調(diào)有關(guān)。RERG 高表達(dá)可能反映了與惡性胸膜間皮瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的“組織分子梯度”上皮部分，因此具有更有利的臨床結(jié)局。ZNF671 是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄抑制因子鋅脂蛋白家族的成員，具有調(diào)節(jié)癌細(xì)胞分化、增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)化的作用。Zhan 等[15]認(rèn)為過(guò)表達(dá)可以抑制Wnt/βcatenin 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Xu 等[16]也證實(shí)在NPC 組織中RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化率更高，同時(shí)聯(lián)合RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化率進(jìn)行早期診斷具有更佳的準(zhǔn)確性。上述分子機(jī)制也進(jìn)一步支持了本研究結(jié)果。本研究經(jīng)ROC 曲線分析，血漿cfDNA RERG 和ZNF671 聯(lián)合診斷價(jià)值也優(yōu)于常規(guī)腫瘤標(biāo)志物CEA，因此檢測(cè)血漿cfDNA有望成為NPC 早期診斷的候選方法。

綜上，RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化率在NPC患者血漿cfDNA 和腫瘤組織中均普遍升高，聯(lián)合檢測(cè)血漿cfDNA RERG、ZNF671 啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)對(duì)NPC 診斷顯示出較高的臨床價(jià)值。盡管本研究存在樣本量小的局限性，但結(jié)果提示血漿cfDNA RERG、ZNF671 甲基化率的組合有望成為基于社區(qū)人群NPC 篩查的候選生物標(biāo)志物。