張強 杜俊煒 楊文鵬 江仁兵

惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是一種具有高度侵襲性、高轉(zhuǎn)移性、預后非常差的皮膚惡性腫瘤[1]，其發(fā)病率在全球各個地區(qū)均呈持續(xù)增長的趨勢[2]。據(jù)統(tǒng)計，美國每年約7 萬人被確診為黑色素瘤，每年因黑色素瘤死亡的人數(shù)約9 千人[3]。盡管中國黑色素瘤的發(fā)病率低于歐美等西方國家，但依舊不容忽視，每年新增黑色素瘤患者約2 萬例[4]。根據(jù)其解剖部位可分為肢端黑色素瘤（acral melanoma，AM）和非肢端黑色素瘤（non-acral melanoma，NAM）[5]。AM 是指發(fā)生在非多毛的肢端皮膚（包括掌側(cè)、指間、甲床），通常認為AM 與慢性紫外線損傷無關(guān)[6]。在以白種人為主的高加索人種中，AM 約占皮膚黑色素瘤病例的10%[7]。然而，在以黃種人為主的亞洲人群中，AM 約占皮膚黑色素瘤病例的50%～70%[8]。雖然國內(nèi)對黑色素瘤基因組的研究已取得很大進展，但大多數(shù)研究主要圍繞常見的熱點突變基因BRAF、NRAS 等[9-10]。此外，國內(nèi)對AM 和NAM 基因突變類型和基因拷貝數(shù)變異（copy number variation,CNV）的研究較少，且基因突變類型與臨床病理特征之間的關(guān)系也尚不清楚。鑒于黑色素瘤基因突變類型及CNV 的研究對于中國人群的治療策略至關(guān)重要，本研究的目標是分析并討論AM 和NAM 的臨床病理特點、基因突變類型及CNV的差異。統(tǒng)計分析AM 與NAM 患者的影響細胞周期畸變相關(guān)基因：細胞周期蛋白依賴性激酶4/6 (cyclin-dependent kinases 4/6,CDK4/6)，細胞周期素D1/2(recombinant cyclin D1/2,CCND1/2)，細胞周期依賴性激酶抑制基因2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A,CDKN2A）；受體酪氨酸激酶相關(guān)基因：表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR），肝細胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor,MET），表皮生長因子受體2/3（epidermal growth factor receptor 2/3,ERBB2/3），血小板源性生長因子受體α 多肽（platelet-derived growth factor receptor alpha,PDGFRA）；抗細胞凋亡相關(guān)基因：桿狀病毒IAP 重復序列2/3/5（baculoviral IAP repeat-containing 2/3/5,BIRC2/3/5）的CNV 情況，旨在深入了解AM 和NAM 的致癌模式和臨床病理特征。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

分析2018年1月至2021年1月在新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤及黑色素瘤科收治并行二代測序（next-generation sequencing,NGS）技術(shù)進行基因檢測的73 例皮膚黑色素瘤患者資料。治療方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準并經(jīng)患者知情同意。納入標準：經(jīng)病理明確診斷為原發(fā)性皮膚黑色素瘤；采用NGS 進行基因檢測者；臨床病理資料及隨訪資料完整可靠。排除標準：繼發(fā)轉(zhuǎn)移的皮膚黑色素瘤患者；未進行NGS 基因檢測者；隨訪資料不完整者；合并其他惡性腫瘤或嚴重疾病者。

1.2 方法

回顧性收集73 例皮膚惡性黑色素瘤患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤厚度、腫瘤有無潰瘍、腫瘤分期、前哨淋巴結(jié)狀態(tài)等臨床病理資料。為了全面地描述黑色素瘤的基因突變情況，采用了NGS 技術(shù)，涵蓋了黑色素瘤相關(guān)的46 個基因，包含12 個基因的熱點突變及34 個基因的拷貝數(shù)變異。根據(jù)黑色素瘤的解剖部位分為肢端組（AMs）和非肢端組（NAMs），對比兩組患者的臨床病理特征、基因突變類型及CNV 的差異。73 例患者均由同一名高年資醫(yī)師行手術(shù)切除，術(shù)后經(jīng)本院病理科明確診斷為原發(fā)性皮膚黑色素瘤。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗及Fisher's 確切概率法進行統(tǒng)計學分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基本信息

NAMs 中男性17 例，女性18 例；AMs 中男性18 例，女性20 例。NAMs年齡29～81 歲，平均年齡（55.03±13.68）歲；AMs年齡26～82 歲，平均年齡（51.89±15.37）歲。NAMs 腫瘤厚度0.40～5.20 mm，平均厚度（2.66±1.59）mm，中位厚度2.30 mm；AMs 腫瘤厚度0.30～5.30 mm，平均厚度（2.70±1.63）mm，中位厚度2.45mm。NAMs 腫瘤表面伴有潰瘍21 例，腫瘤表面不伴有潰瘍14 例；AMs 腫瘤表面伴有潰瘍17 例，腫瘤表面不伴有潰瘍21 例。NAMs 腫瘤原發(fā)解剖部位分別為軀干9 例、頭/頸部4 例、四肢22 例。NAMs 前哨淋巴結(jié)陽性有7 例，陰性28 例；AMs 前哨淋巴結(jié)陽性有9 例，陰性有29 例。NAMs 腫瘤分期：Ⅰ期有8 例，Ⅱ期有15 例，Ⅲ期有10 例，Ⅳ期2 例；AMs 腫瘤分期：Ⅰ期有9 例，Ⅱ期有14 例，Ⅲ期有12 例，Ⅳ期3 例。兩組患者的性別、年齡、潰瘍、腫瘤厚度、前哨淋巴結(jié)狀態(tài)、AJCC 腫瘤分期均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 兩組患者的基本臨床病理特征

2.2 AMs 和NAMs 的基因突變情況

本研究中最常見的基因組亞型為野生型（wild type,WT） (44.9%)，其次是BRAF 突變（20.5%）、NRAS/KRAS 突變（17.8%）、KIT 突變（13.7%），其余罕見的突變類型約占3.1%。在BRAF 突變病例中，86.7%（13/15）為V600E 突變，2 例為非V600E 突變。BRAF 突變腫瘤部位最常見于四肢，約53.3%（8/15）；其次是肢端，約26.7%（4/15）。在以65 歲為界限進行分組時發(fā)現(xiàn)，兩組患者之間BRAF 突變有顯著性差異（P=0.029）。此外，在以腫瘤是否伴有潰瘍進行分組時，伴有潰瘍與無潰瘍兩組患者之間BRAF 突變具有顯著性差異（P=0.027）（表2）。NRAS 和KRAS 基因突變約53.8%（7/13）位于第3 外顯子、約30.8%（4/13）位于第2 外顯子、約15.4%（2/13）位于外顯子4。10例KIT 突變中，7 例位于第11 外顯子（包括V560D、D572G 和L576P 突變），3 例位于第13/14/17 外顯子（包括K642E、D820Y、N822K 突變）。45 例BRAF/KRAS/NRAS 野生型中發(fā)現(xiàn)9 例存在KIT 基因突變；28 例存在BRAF/KRAS/NRAS 突變中僅1 例合并KIT 基因突變；KIT 基因在BRAF/KRAS/NRAS 野生型中的突變頻率顯著高于突變型（P=0.043）。在NAMs 中最常見的突變類型為BRAF 突變，BRAF 突變率約為31.4%（11/35）、KIT 突變率約為11.4%（4/35）、KRAS/NRAS 突變率約為11.4%（4/35）。AMs 中最常見的突變類型為KRAS/NRAS 突變，KRAS/NRAS突變率約為23.7%（9/38）、KIT 突變率約為15.8%（6/38）、BRAF 突變率約為10.5%（4/38）。AMs 和NAMs 兩組患者之間BRAF 突變差異具有統(tǒng)計學差異（P=0.027）。AMs 和NAMs 兩組患者之間KRAS/NRAS 突變差異并無統(tǒng)計學意義（P=0.172）。AMs和NAMs 兩組患者之間KIT 突變差異并無統(tǒng)計學意義（P=0.738）。

表2 BRAF 突變與年齡及腫瘤潰瘍之間的相關(guān)性

2.3 AMs 和NAMs 的基因拷貝數(shù)變異情況

AMs 中基因拷貝數(shù)增多的高頻基因分別是CCND1，約39.5%（15/38）；其次是CDK4，約28.9%（11/38）；BIRC5，約26.3%（10/38）。AMs 中基因拷貝數(shù)缺失的高頻基因分別是CDKN2A，約18.4%（7/38）；其次是PTEN，約13.2%（5/38）。NAMs 中基因拷貝數(shù)增多的高頻基因為CCND1，約14.3%（5/35）、其次是CDK4，約8.6%（3/35）；BIRC5 約8.6%（3/35）。NAMs 中基因拷貝數(shù)缺失的高頻基因為PTEN，約11.4%（4/35）；其次是CDKN2A，約5.7%（2/35）。將CNV 按基因組區(qū)域近一步分為3 個亞組，包括：影響細胞周期畸變相關(guān)基因（CDK4/6、CCND1/2 和CDKN2A）；影響受體酪氨酸激酶相關(guān)基因（EGFR、MET、ERBB2、ERBB3、PDGFRA）；抗細胞凋亡相關(guān)基因（BIRC2/3/5）。本研究結(jié)果顯示，AMs 中影響細胞周期畸變相關(guān)基因（CDK4/6 、CCND1/2 和CDKN2A）、影響受體酪氨酸激酶相關(guān)基因（EGFR、MET、ERBB2、ERBB3、PDGFRA）和抗細胞凋亡相關(guān)基因（BIRC2/3/5）的CNV 均高于NAMs，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.019，0.002，0.027） （表3）。

表3 AM 與NAM 患者基因突變及CNV 情況

2.4 AMs 患者的組內(nèi)比較

根據(jù)解剖部位將AM 進一步細分為掌側(cè)黑色素瘤、指間黑色素瘤、甲下黑色素瘤。38 例肢端黑色素瘤患者中13 例為手足掌側(cè)黑色素瘤，11 例為甲下黑色素瘤，14 例為指間黑色素瘤。進一步比較了掌側(cè)黑色素瘤、指間黑色素瘤和甲下黑色素瘤的基因突變類型。其中BRAF 基因突變僅出現(xiàn)在掌側(cè)黑色素瘤，且突變均為V600E。指間黑色素瘤中KRAS/NRAS 突變約占1/3，而甲下均未發(fā)現(xiàn)BRAF/KRAS/NRAS 突變。掌側(cè)和指間黑色素瘤的BRAF/KRAS/NRAS 突變顯著高于甲下黑色素瘤（P=0.038）。此外，在2 例甲下、1 例指間和3 例掌側(cè)黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了KIT 突變。38.5%（5/13）掌側(cè)、72.7%（8/11）甲床和78.6%（11/14）的指間黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了CNV 事件，但并無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

3 討論

隨著國內(nèi)學者對黑色素瘤研究的深入，對MM 的基因檢測現(xiàn)已成為必不可少的常規(guī)操作[11]。目前已有研究報道，黑色素瘤驅(qū)動基因突變在不同黑色素瘤亞型之間具有顯著性差異[12]。本研究73 例患者中最常見的基因亞型為野生型（WT） (44.9%)，其次是BRAF突變（20.5%）、NRAS/KRAS 突變（17.8%）、KIT 突變（13.7%），其余罕見的突變類型約占3.1%。雖然在TCGA 黑色素瘤隊列中，BRAF 亞型為最常見的基因組亞型[13]，但在本研究中，最常見的是WT 亞型。

在本研究中BRAF 突變是NAMs 中最常見的突變類型，在35 例NAMs 中有11 例檢測到BRAF 基因突變，突變率約為31.4%，其中9 例為V600E 突變，2 例為非V600E 突變。在AMs 中，NRAS/KRAS 突變是最常見的突變類型，在38 例AMs 中有9 例檢測到NRAS/KRAS 突變，突變率約為23.7%。這也許能解釋大量的肢端黑色素瘤患者并不能從BRAF 抑制劑中獲益[14]。此外，在以65 歲為界限進行年齡分組時，發(fā)現(xiàn)65 歲以上的患者僅1 例檢測到BRAF 基因突變，65 歲以下患者有14 例檢測到BRAF 基因突變，其差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.029）。這與之前的研究結(jié)果一致，BRAF 基因突變可能更易發(fā)生在年輕患者中[15-16]。在以腫瘤是否伴有潰瘍進行分組時發(fā)現(xiàn)，不伴有潰瘍的35 例患者中有11 例檢測到BRAF 突變，伴有潰瘍的38 例患者中僅4 例檢測到BRAF 突變，兩者的差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.027），這也許意味著不伴有潰瘍的黑色素瘤比伴有潰瘍的黑色素瘤更易出現(xiàn)BRAF 突變。本研究發(fā)現(xiàn)NRAS/KRAS 是AMs中最常見的突變類型，在38 例AMs 中9 例檢測到NRAS/KRAS 突變，突變率約為23.7%，但在AM 和NAM 之間NRAS/KRAS 突變的差異并無統(tǒng)計學意義（P=0.172）。

本研究73 例患者中檢測到10 例具有KIT 基因突變，突變率約為13.7%，與之前的研究報道（13%）基本一致[17]。KIT 基因在BRAF/KRAS/NRAS 野生型和突變型之間突變頻率的差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.043）。與此前關(guān)于亞洲黑色素瘤研究的報道相比，本研究AM 中BRAF 突變頻率低于先前的報道[18]；KRAS/NRAS 突變率與先前的研究相似[19]。除了潛在的地區(qū)種族因素外，這些差異可能是由于本研究中的AMs 大多為雀斑型黑色素瘤，結(jié)節(jié)狀和淺表擴散型在AM 隊列中很少見。

CNV 是由基因組發(fā)生重排而導致的，一般指長度為1 kb 以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少，主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復，CNV 是基因組結(jié)構(gòu)變異（structural variation，SV）的重要組成部分。本研究中AMs 的CNV 發(fā)生頻率顯著高于NAMs，這可能是在臨床治療中AMs 預后較差的原因之一。細胞周期畸變是黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的常見事件[20]，本研究表明，影響細胞周期畸變的CNV 事件在AMs 中更常見。在35 例NAMs 中檢測到9 例細胞周期畸變相關(guān)基因（CDK4/6、CCND1/2、CDKN2A）的CNV 事件，38 例AMs 中檢測到20 例細胞周期畸變相關(guān)基因（CDK4/6、CCND1/2、CDKN2A）的CNV事件，差異具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。此外，有文獻指出細胞周期畸變與惡性黑色素瘤患者的不良預后顯著相關(guān)。因此，這或許能為應用細胞周期抑制劑靶向治療AM 患者提供證據(jù)。

受體酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase，RTK）途徑被確定為黑色素瘤發(fā)展的驅(qū)動因素之一[21]。本研究數(shù)據(jù)表明，在38 例AMs 中，有18 例患者的CNV 事件與RTK 相關(guān)（EGFR、MET、ERBB2、ERBB3、PDGFRA）；而在NAMs 中僅檢測到5 例，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。本研究的結(jié)果證實了AMs 中RTK 改變的異質(zhì)性，這也許能為治療AMs 提供一個合理的假設，即具有識別特殊組合的酪氨酸激酶抑制劑，或許能為AMs 患者提供一個新的治療方案[21]。

抗凋亡分子可以保護黑色素瘤細胞免于凋亡，從而增強其侵襲性。BIRC2/3/5 基因編碼細胞凋亡抑制蛋白1/2[22]。在本結(jié)果中，BIRC5 的基因拷貝數(shù)增加在AMs 和NAMs 中均被檢測到，但BIRC2/3 的拷貝數(shù)增加僅在AMs 中檢測到。在35 例NAMs 中僅檢測到3 例具有BIRC5 的拷貝數(shù)增加；而在AMs 中檢測到11 例具有BIRC2/3/5 的拷貝數(shù)增加，AMs 與NAMs 的BIRC2/3/5 拷貝數(shù)變異頻率具有統(tǒng)計學差異（P=0.027）。因此，檢測BIRC2/3/5 基因表達可作為原發(fā)AM 新的預后指標。

掌側(cè)、指間和甲床黑色素瘤之間的基因組差異也有報道[23]。在本研究中，38 例AM 患者中13 例位于掌側(cè)，11 例位于甲下，14 例位于指間。進一步比較掌側(cè)、指間和甲床的基因突變頻率。BRAF 基因突變僅出現(xiàn)在掌側(cè)，且均為V600E 突變。指間中KRAS/NRAS 突變約占1/3，而甲下均未發(fā)現(xiàn)BRAF/KRAS/NRAS 突變。在之前的報道中，掌側(cè)黑色素瘤約11%存在CNV[23],但在本文研究中，掌側(cè)部位的黑色素瘤約有38.5%（5/13）檢測到至少存在一種CNV 事件，有報道在AMs 中CNV 發(fā)生的頻率高達75%[24]。同時，在本研究結(jié)果中，掌側(cè)、甲下、指間黑色素瘤的CNV 事件并無顯著差異。

綜上所述，本研究存在一定局限性，首先，未分析來自匹配正常組織的任何基因組，考慮到這是一項回顧性研究，未收集成對的正常組織進行NGS 測定。因此，不能區(qū)分其突變是否來自生殖系或體細胞組織。此外，分析中只包括致病性或可能致病性突變，不包括意義未知的突變，亟需更大樣本進一步驗證。