張國妤 齊曉霞 陸宏偉 盧樂

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，陜西 西安 710004)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染是全世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題之一。據(jù) WHO統(tǒng)計，全世界約有20億人曾感染過HBV，而其中超過2.96億是慢性HBV感染者，每年全球大約有82萬人死于HBV感染及其相關(guān)疾病[1]。HBV感染機(jī)體后，主要是由于細(xì)胞免疫對肝細(xì)胞的致病作用對機(jī)體造成損傷。近年來，與免疫調(diào)節(jié)呈負(fù)性相關(guān)的幾個重要的免疫抑制性分子——程序性細(xì)胞死亡分子-1(programmed cell death-1, PD-1)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4, CTLA-4)、T 細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM-3)由于在慢性感染中發(fā)揮著重要作用而倍受關(guān)注[2-3]。miRNA 是一類非常重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可以通過對靶mRNA 的負(fù)性調(diào)控作用，影響生物體的生長發(fā)育，細(xì)胞的凋亡，疾病的發(fā)生等。miRNA 與靶mRNA 分子3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region, 3′UTR)的特異性結(jié)合是調(diào)控mRNA 水平和蛋白表達(dá)的關(guān)鍵。miRNA 與靶基因mRNA 的結(jié)合效率依賴于mRNA 的序列以及分子內(nèi)結(jié)構(gòu)。而miRNA 靶基因SNP能夠?qū)е耺RNA 側(cè)翼區(qū)域結(jié)構(gòu)的改變，建立新的miRNA 靶結(jié)合位點或去掉原有的靶結(jié)合位點，影響miRNA 的結(jié)合效率和靶基因的表達(dá)[4-5]。因此，miRNA 靶序列SNP 可以通過影響miRNA 與靶mRNA 3′UTR 的結(jié)合，參與基因功能的調(diào)控。有研究已經(jīng)報道了PD-1 3′UTR的rs10204525位點和CTLA-4 3′UTR的rs3087243位點在HBV感染中分別發(fā)揮著作用[6-7]。因此，我們通過病例對照研究探討慢性HBV感染者PD-1和CTLA-4 3′UTR的基因多態(tài)性分布，以及兩者之間的交互作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年8月～2013年6月慢性HBV感染者433例，其中男328例，女105例，平均年齡(39.33±13.20)歲。所有病例的診斷均符合2019年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除合并有其它肝臟疾病(甲型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎、藥物性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、Wilson's 病)、可引起高代謝的疾病(包括糖尿病, 獲得性免疫缺陷綜合癥，甲狀腺功能亢進(jìn))、伴隨嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及腎功能損害和年齡不滿18歲的患者。433例HBV感染者的臨床分型為47例無癥狀攜帶者(Asymptomatic carriers，ASC)，154例慢性肝炎(Chronic hepatitis，CH)，130例肝硬化(Liver cirrhosis，LC)和102例肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)。健康對照者208例，為中國陜西籍或長期居住在陜西地區(qū)無血緣關(guān)系的健康獻(xiàn)血員和健康體檢者，其中男151例，女57例；平均年齡(38.17±14.22)歲。兩組在年齡與性別間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對象均知情同意和自愿參加。

1.2 DNA提取 所有受試者清晨空腹抽血2 mL，用EDTA抗凝后，-20℃冷凍保存待提取人類基因組DNA。用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.3 基因型分析 采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)進(jìn)行基因型分析[8-9]。引物序列、內(nèi)切酶、產(chǎn)物長度見表1。

表1 PD-1和CTLA-4基因多態(tài)性使用的引物序列、內(nèi)切酶、PCR產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequences, endonucleases, PCR product lengths used for PD-1 and CTLA-4 gene polymorphisms

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。基因型頻率用Hardy-Weinberg平衡檢驗。HBV感染組與健康對照組的基因型頻率、等位基因頻率、基因間的交互作用、與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，用2檢驗進(jìn)行計算。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1和CTLA-4的基因型和等位基因頻率 PD-1 rs10204525 A/G和CTLA-4 rs3087243 A/G基因型在HBV感染組和健康對照組的的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，見表2。 PD-1 rs10204525、CTLA-4 rs3087243在HBV感染組和健康對照組中的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。PD-1 rs10204525：與GG基因型相比，慢性HBV感染組的AA基因型頻率明顯高于健康對照組(P=0.019,OR=2.231, 95%CI=1.127～4.418)，A等位基因頻率明顯高于健康對照組(P=0.033,OR=1.334, 95%CI=1.024～1.739)。CTLA-4 rs3087243：與AA基因型相比，慢性HBV感染組的GG基因型頻率明顯高于健康對照組(P=0.016,OR=2.196, 95%CI=1.145～4.214)，G等位基因頻率明顯高于健康對照組(P=0.040,OR=1.320, 95%CI=1.012～1.723)。見表3。

表2 H-W平衡檢驗Table 2 Hardy-Weinberg equilibrium

表3 PD-1和CTLA-4的基因型和等位基因分析[n,n(×10-2)]Table 3 Genotype and allele frequencies of PD-1 and CTLA4 polymorphisms

2.2 PD-1和CTLA-4的基因型交互作用 以HBV易感基因型PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)作為參照，因PD-1 rs10204525(GG)、CTLA-4 rs3087243(AA)基因型太少，遂分別將二者少見基因型合并分析。發(fā)現(xiàn)組合基因型在HBV感染組和健康對照組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表4、5。與PD-1 rs10204525(GG)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在慢性HBV感染組的分布頻率高于健康對照組(P=0.009,OR=5.298, 95%CI=1.338～20.983)。與PD-1 rs10204525(AA)基因型使乙肝的發(fā)病危險性升高2.231倍相比，CTLA-4 rs3087243(GG)基因型顯著升高了基于PD-1 rs10204525基礎(chǔ)上的乙肝發(fā)病危險。與PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在慢性HBV感染組的分布頻率高于健康對照組(P=0.002,OR=4.995, 95%CI=1.684～14.820)。與CTLA-4 rs3087243(GG)基因型使乙肝的發(fā)病危險性升高2.196倍相比，PD-1 rs10204525(AA)基因型顯著升高了基于CTLA-4 rs3087243基礎(chǔ)上的乙肝發(fā)病危險。

表4 將攜帶有CTLA-4少見基因型合并后的組合基因型分析Table 4 Combined genotype analysis after combining rare genotypes with CTLA-4

表5 將攜帶有PD-1少見基因型合并后的組合基因型分析Table 5 Combined genotype analysis after combining rare genotypes with PD-1

2.3 PD-1和CTLA-4基因型和等位基因與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系 將HBV感染組按疾病嚴(yán)重程度分為無癥狀攜帶者、慢性肝炎、肝硬化和肝癌組，發(fā)現(xiàn)PD-1 rs10204525各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CTLA-4 rs308724基因型和等位基因各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6。進(jìn)一步組間分析發(fā)現(xiàn)，PD-1 rs10204525各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而在CTLA-4 rs308724組中，與GA基因型相比，ASC組的GG基因型頻率低于HCC組(P=0.026,OR=0.411, 95%CI=0.154～0.508)，ASC組的G等位基因頻率低于HCC組(P=0.018,OR=0.483, 95%CI=0.263～0.888)；與GA基因型相比，CH組的GG基因型頻率低于HCC組(P<0.001,OR=0.279, 95%CI=0.172～0.568)，G等位基因頻率低于HCC組(P<0.001,OR=0.442, 95%CI=0.277～0.704)；與GA基因型相比，LC組的GG基因型頻率低于HCC組(P<0.001,OR=0.336, 95%CI=0.182～0.620)，G等位基因頻率低于HCC組(P=0.012,OR=0.541, 95%CI=0.332～0.879)。提示CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能與HCC感染相關(guān)。

表6 PD-1和CTLA-4的基因型和等位基因與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系Table 6 Genotype and allele frequencies of PD-1 and CTLA-4 polymorphisms in hepatitis B virus infected patients with different clinical diagnoses

2.4 PD-1和CTLA-4組合基因型與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系 以HBV易感基因型PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)作為參照，因PD-1 rs10204525(GG)、CTLA-4 rs3087243(AA)基因型太少，遂將二者少見基因型合并分析，發(fā)現(xiàn)組合基因型在各組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表7。進(jìn)一步組間分析發(fā)現(xiàn)：與PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在ASC組、CH組的分布頻率分別低于HCC組(P=0.013,OR=0.233, 95%CI=0.070～0.779和P=0.001,OR=0.197, 95%CI=0.071～0.543)；與PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4rs3087243(GG)組合基因型組在CH組的分布頻率低于HCC組(P=0.045,OR=0.515, 95%CI=0.268～0.990)；與PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在LC組的分布頻率高于HCC組(P=0.007,OR=2.847, 95%CI=1.314～6.165)；與PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在CH組的分布頻率低于LC組(P=0.029,OR=0.452, 95%CI=0.219～0.932)。

表7 PD-1和CTLA-4組合基因型與疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系Table 7 Combined analysis of PD-1 and CTLA-4 polymorphisms in hepatitis B virus infected patients with different clinical diagnoses

2.5 PD-1和CTLA-4組合基因型與肝癌的關(guān)系 以HCC易感基因型PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GG)作為參照，因PD-1 rs10204525(GG)、CTLA-4 rs3087243(AA)基因型太少，遂將二者少見基因型合并分析。發(fā)現(xiàn)組合基因型在肝癌組和非肝癌組中的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表8。與PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)、PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)、PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GA+AA)組合基因型組相比，PD-1 rs10204525(AG+GG)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型組在非肝癌組的分布頻率低于肝癌組(分別為P<0.001,OR=0.240, 95%CI=0.119～0.482；P=0.006,OR=0.437, 95%CI=0.242～0.790；P<0.001,OR=0.116, 95%CI=0.041～0.328)。

表8 PD-1和CTLA-4組合基因型與肝癌的關(guān)系Table 8 Combined analysis of PD-1 and CTLA-4 polymorphisms in patients with or without HCC

3 討論

PD-1是一種抑制性免疫受體，屬于免疫球蛋白超家族，主要在活化的淋巴細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)[10]。一旦與它的兩個配體PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)連接，PD-1可以下調(diào)T細(xì)胞增殖和活性，抑制細(xì)胞因子分泌，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。PD-1基因位于染色體的2q37.3，由5 個外顯子和4 個內(nèi)含子組成。作為腫瘤免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵靶點，PD-1和它的兩個配體基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)變異研究主要集中于腫瘤中，也包括本研究所探討的rs10204525位點，如肺癌、結(jié)直腸癌、上消化道癌等[11-13]。隨著對PD-1研究的不斷深入，逐漸發(fā)現(xiàn)許多引起慢性感染的微生物都可能利用了PD-1-PD-L通路削弱抗感染免疫，并造成持續(xù)的感染狀態(tài)[14-15]。因此，對PD-1基因多態(tài)性在慢性HBV感染中的研究也逐漸進(jìn)入人們的視野。位于基因3′UTR的SNP可通過與miRNA特異性結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控mRNA和蛋白的表達(dá)。已有研究發(fā)現(xiàn)PD-1非編碼區(qū)的基因多態(tài)性可以通過改變外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的細(xì)胞因子產(chǎn)生和PD-1表達(dá)而與HBV感染的慢性和進(jìn)展相關(guān)[16-18]。本研究也有類似發(fā)現(xiàn)，PD-1 rs10204525的AA基因型和A等位基因可能是慢性HBV感染的危險因素。

CTLA-4基因同PD-1 基因一樣也位于2 號染色體上(2q33～q37)，包含4 個內(nèi)含子和3 個外顯子，目前已發(fā)現(xiàn)若干個基因多態(tài)性位點，這些SNPs 可能影響CTLA-4 的表達(dá)量以及結(jié)構(gòu)和功能。但有關(guān)CTLA-4非編碼區(qū)的基因多態(tài)性的研究卻相對較少，僅見于一些自身免疫性疾病和過敏性疾病[19-20]。本次研究探討了CTLA-4基因3′UTR的SNP差異在HBV感染中的作用。發(fā)現(xiàn)CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能是慢性HBV感染的危險因素。且CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能與HCC感染相關(guān)，這與其他研究結(jié)果一致[21]。進(jìn)一步將CTLA-4和PD-1基因進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合基因型可增加慢性HBV感染的危險因素，PD-1 rs10204525(AA)CTLA-4 rs3087243(GG)組合基因型分別增強(qiáng)了PD-1 rs10204525(AA)基因型(OR從2.231增至5.298)和CTLA-4 rs3087243(GG)基因型(OR從2.196增至4.995)的發(fā)病風(fēng)險。

PD-1和CTLA-4作為作為T 細(xì)胞表面一種重要的抑制性共刺激分子，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，并維持著外周免疫耐受[22-25]，兩者的表達(dá)水平與慢性HBV感染的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)PD-1和CTLA-4基因3′UTR的SNP差異與慢性HBV感染的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，且兩者間存在交互作用。可能通過影響基因3′UTR 與miRNA的結(jié)合，進(jìn)而影響PD-1 和CTLA-4的表達(dá)水平，最終影響慢性乙型肝炎的發(fā)病風(fēng)險。這可能有助于深入了解它們在遺傳學(xué)上與HBV 感染易感性、疾病進(jìn)展以及結(jié)局的關(guān)系，為HBV 感染基于基因信息的個體化防治提供新的策略。

4 結(jié)論

PD-1 rs10204525的AA基因型和A等位基因可能是慢性HBV感染的危險因素，CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能是慢性HBV感染的危險因素。聯(lián)合基因型可增加慢性HBV感染的危險因素。CTLA-4 rs3087243的GG基因型和G等位基因可能與HCC感染相關(guān)。