特日格勒 愛倫高娃 格格恒 李秦宇琦 韓穎 馬成

(赤峰學院附屬醫(yī)院生殖中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

體外受精-胚胎移植(In vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)是一項用于治療不孕不育的醫(yī)學前沿技術(shù)，這種人類輔助生殖技術(shù)雖然已被廣泛應用于不孕癥的治療，但受孕率仍不盡理想[1]。IVF實驗室就像一座“加工廠”，直接影響IVF結(jié)局，胚胎質(zhì)量是判斷輔助生殖技術(shù)成功與否的重要因素，體外培養(yǎng)的胚胎失去母體的自身保護，在沒有任何保護屏障的情況下，對生存的微環(huán)境相當敏感，極有可能影響其生長發(fā)育潛能[2]。因此，在輔助生殖前，需要嚴格把控IVF實驗室質(zhì)量，全方位檢測各個環(huán)節(jié)，建立穩(wěn)定、可靠的培養(yǎng)體系，以確保為胚胎的生長發(fā)育提供相對穩(wěn)定的場所。目前，鼠胚實驗是監(jiān)測IVF實驗室各種培養(yǎng)液、實驗耗材及實驗設備質(zhì)量的常用生物方法[3]，本生殖中心于2019年初完成胚胎實驗室建立，并對其進行為期一個月的“熱處理”[4]，之后進行雌鼠體內(nèi)外受精和胚胎培養(yǎng)實驗評估IVF實驗室質(zhì)量，旨在為臨床IVF-ET提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雌性昆明系小鼠30只6周齡，體重20～22 g，SPF級健康雄性昆明系小鼠8只8周齡，體重30～33 g，購自北京北科華夏生物醫(yī)藥科技有限公司，使用許可證號SYXK(京)2017-0044，室溫20～25℃，相對濕度40%～60%，12 h晝夜交替。本研究獲得醫(yī)院動物倫理委員會審核批準。

1.2 試劑和儀器 孕馬血清促性腺激素(Pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)和絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin，hCG)購自杭州動物藥品廠；卵裂液(CSC)、人輸卵管液(Human tubal fluid，HTF)以及HEPES緩沖的人輸卵管液(modified human tubal fluid，mHTF)購自歐文公司；人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)、洗精受精液、卵裂胚培養(yǎng)液G1和囊胚培養(yǎng)液G2購自瑞典Vitrolife公司；超凈工作臺購自美國Thermo公司；解剖顯微鏡購自日本Olympus公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Bio-Rad公司；培養(yǎng)皿、試管等購自美國Falcon公司。

1.3 小鼠超排卵[5]用生理鹽水將PMSG和hCG配成100 U/mL的溶液存于-20℃待用，培養(yǎng)液在使用前一天配制后置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中過夜平衡。雌鼠腹腔注射PMSG 10 U/只，48 h后腹腔注射hCG 10 U/只。

1.4 體外受精實驗

1.4.1 采集卵母細胞[6]14只雌性小鼠腹腔注射hCG 16 h后，頸椎脫臼法處死，無菌環(huán)境下取出輸卵管，用胚胎處理液和10% HSA清洗3次，在體視鏡下用1 mL注射器刺破輸卵管膨大部位，使卵子團釋放，收集后轉(zhuǎn)移至洗精受精液中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.2 采集精子并獲能 頸椎脫臼法處死雄鼠，無菌環(huán)境下取出附睪尾，用胚胎處理液和10% HSA清洗3次，用鑷子輕輕取出精子，收集后轉(zhuǎn)移至含有洗精受精液的試管中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中獲能30～60 min。

1.4.3 體外受精 收集獲能后的精子于一支新的試管中，取適量精子懸液加入至含有卵子團的洗精受精液中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后，將卵子轉(zhuǎn)移到另一新的含有洗精受精液的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 體內(nèi)受精實驗 剩余的16只雌性小鼠腹腔注射hCG后，將雌雄小鼠按照2∶1的比例合籠，第二天清晨將出現(xiàn)陰栓的雌鼠頸椎脫臼法處死，無菌環(huán)境下取出輸卵管，胚胎處理液和10% HSA清洗3次，在體視鏡下用1 mL注射器刺破輸卵管膨大部位，使合子釋放，收集后轉(zhuǎn)移至洗精受精液中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.6 原核及卵裂期胚胎觀察與培養(yǎng) 培養(yǎng)第0天下午顯微鏡下觀察原核合子形態(tài)；第一天上午觀察2細胞期胚胎，之后將2細胞期胚胎轉(zhuǎn)移至過夜平衡后的卵裂培養(yǎng)液中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；第二天上午觀察4細胞期胚胎，下午觀察8細胞期胚胎，并將8細胞期胚胎轉(zhuǎn)移至過夜平衡后的囊胚培養(yǎng)液中，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；第三天上午觀察桑葚期胚胎；第四天觀察早期囊胚；第五天上午觀察囊胚。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間比較采用2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體外受精結(jié)果 本次實驗共進行20個體外受精周期實驗，共獲卵946枚，原核受精胚751個，受精率79.39%，2細胞數(shù)697枚，卵裂率92.80%，2細胞形成囊胚558個，囊胚形成率80.06%，見表1。

2.2 體內(nèi)受精結(jié)果 共進行了14個體內(nèi)受精周期實驗，共獲卵618枚，原核受精胚499個，受精率80.74%，2細胞數(shù)453個，卵裂率90.78%，2細胞形成囊胚368個，囊胚形成率81.24%，見表2。

2.3 兩組小鼠胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果 體內(nèi)受精組和體外受精組相比，受精率、卵裂率和囊胚形成率組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組小鼠胚胎體外培養(yǎng)結(jié)果比較[n(×10-2)]Table 3 Comparison of in vitro culture results between the two groups of mouse embryos

2.4 小鼠胚胎形態(tài)觀察 顯微鏡下觀察不同發(fā)育階段的小鼠胚胎，見圖1。

圖1 體外受精后不同發(fā)育階段的小鼠胚胎(10×)Figure 1 Mouse embryos at different stages of development after in vitro fertilization

3 討論

人類輔助生殖技術(shù)是治療不孕不育的重要手段，其主要包括卵母細胞體外受精、胚胎早期體外培養(yǎng)和優(yōu)質(zhì)胚胎移植等過程[7]。但在IVF-ET過程中多個環(huán)節(jié)會影響胚胎質(zhì)量，導致妊娠率降低，例如超促排卵、采卵或采精過程以及配子或胚胎培養(yǎng)過程中所使用的器皿和試劑等因素[8]。因此，實驗室質(zhì)量是輔助生殖技術(shù)成功的重要保障。由于小鼠胚胎的生長發(fā)育經(jīng)歷接近于人胚胎，因此鼠胚實驗成為檢測人早期胚胎體外生長發(fā)育環(huán)境的最佳模式，不僅能反應胚胎的發(fā)育潛能，還能檢測實驗室質(zhì)量及實驗人員的操作技能[9-11]。本研究通過檢測體外鼠胚胎培養(yǎng)實驗中的卵裂率和囊胚率，從而對本院建立的生殖胚胎實驗室質(zhì)量進行評估。

胚胎的生長發(fā)育受多種因素的影響，如溫度、濕度、CO2濃度以及離子濃度等都會影響受精卵和早期胚胎生存發(fā)育[12-13]。研究表明，注射hCG后隨受精時間的延長，優(yōu)質(zhì)胚胎率呈增高趨勢[14]。生長激素預處理可明顯提高卵巢低反應患者體外受精的結(jié)局[15]。本研究結(jié)果表明，體內(nèi)獲得的原核受精胚發(fā)育狀況良好，體外獲得的原核受精胚同樣可發(fā)育至囊胚階段，受精率、卵裂率和2細胞囊胚形成率兩組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義。雖然各指標偏低，但均符合人類輔助生殖實驗室質(zhì)控標準。本實驗結(jié)果說明本院輔助生殖實驗室的培養(yǎng)體系和技術(shù)員的操作水平已合格。通過對本研究中各周期的受精率和囊胚率分析，仍發(fā)現(xiàn)實驗中多種因素影響胚胎形成和發(fā)育過程。從體內(nèi)受精實驗結(jié)果和體外受精實驗結(jié)果數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，不同周期受精率、卵裂率和囊胚形成率波動較大，相對不穩(wěn)定，我們猜測可能是由于實驗過程中，頻繁開關(guān)培養(yǎng)箱，造成培養(yǎng)箱內(nèi)溫度變化大，且CO2濃度在一定時間段內(nèi)過低造成。研究表明，溫度降低不利于胚胎生存[16]。另一方面，可能由于技術(shù)人員操作技術(shù)不嫻熟，操作過程中培養(yǎng)皿離開溫度穩(wěn)定、飽和濕度的培養(yǎng)箱時間過長，造成胚胎滲透壓改變，而滲透壓對維持細胞的穩(wěn)定生長至關(guān)重要[17]。此外，長時間的觀察使胚胎體外曝光時間過長，而研究發(fā)現(xiàn)，光照影響胚胎的生長發(fā)育[18]，通過不斷發(fā)現(xiàn)問題，解決問題，同時實驗操作人員技術(shù)不斷提高，受精率、卵裂率和囊胚形成率也在不斷升高，但是不同周齡的小鼠或處于不同發(fā)情期的小鼠、卵泡液中微生物的存在、體質(zhì)量等因素都是影響胚胎發(fā)育的關(guān)鍵，周齡較長則會造成精子和卵子質(zhì)量下降，影響實驗結(jié)果[19-21]。因此，在實驗過程中嚴格把控實驗條件和實驗過程中所用到的試劑和儀器設置參數(shù)。

4 結(jié)論

鼠胚實驗中多種因素影響受精率和囊胚形成率，因此不僅要嚴格控制影響胚胎生長發(fā)育的微環(huán)境，還要不斷提高操作人員的技術(shù)水平，在鼠胚實驗中任何細節(jié)都不容忽視，為建立具有合格的實驗室質(zhì)量控制體系和質(zhì)量保障系統(tǒng)提供一定的參考價值。但胚胎質(zhì)量受多種因素影響，如實驗小鼠的品系、小鼠質(zhì)量以及小鼠周齡等，總之，輔助生殖實驗室必須建立完整系統(tǒng)的質(zhì)量控制體系，以確保能夠安全穩(wěn)定運行。