吳鍵 柳華 張?jiān)栖?羅麗華 楊志秀 尚正良 劉姚 隆昱洲

(1.云南大學(xué)附屬醫(yī)院·云南省第二人民醫(yī)院·云南省眼科醫(yī)院神經(jīng)外科，云南 昆明 650021；2.成都市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 成都 610014；3.云南大學(xué)附屬醫(yī)院·云南省第二人民醫(yī)院·云南省眼科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650021)

腦卒中是一種常見(jiàn)的具有高致殘率和高死亡率的疾病，其中主要為缺血性腦卒中(Ischemic stroke,IS)，其發(fā)生率和死亡率分別為0.247%和0.115%[1]。在我國(guó)，IS發(fā)生后1年內(nèi)，病死率高達(dá)11.4%～15.4%[2]。目前，治療缺血性腦卒中安全有效的方法是3 h內(nèi)使用重組人組織型纖溶酶原激活物(Recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA)進(jìn)行溶栓治療[3]。然而，受限于極窄的溶栓時(shí)間窗，在我國(guó)僅有2.4%的患者進(jìn)行了有效的溶栓治療，遠(yuǎn)低于美國(guó)的25.1%[4]。腦缺血損傷后，產(chǎn)生大量的氧化自由基，進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、腦水腫、腦梗死。研究表明，依達(dá)拉奉作為一種氧化自由基清除劑，在缺血性腦卒中能夠抑制氧化自由基導(dǎo)致的損傷，發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[3-4]。此外，在創(chuàng)傷性腦外傷模型中發(fā)現(xiàn)，依達(dá)拉奉能夠降低氧化自由基水平并減少損傷體積[5]。硫氧還蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein, TXNIP)是細(xì)胞內(nèi)源性氧化應(yīng)激和炎癥調(diào)節(jié)因子，在缺血性疾病中發(fā)揮重要作用。研究表明，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)通過(guò)ROS敏感的TXNIP激活NLRP3(NLR Family Pyrin Domain Containing 3)炎癥小體[6-7]。NLRP3/ASC/caspase-1信號(hào)通路激活后，細(xì)胞合成并釋放IL-1β， IL-18導(dǎo)致神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和焦亡[8-9]。因此，本研究認(rèn)為依達(dá)拉奉可通過(guò)ROS/TXNIP/NLRP3信號(hào)通路降低缺血性腦卒中神經(jīng)元的損傷。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)的SD大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元來(lái)研究依達(dá)拉奉對(duì)缺氧神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康出生24 h內(nèi)新生SD大鼠16只，購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)均按照中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用科學(xué)技術(shù)委員會(huì)進(jìn)行，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)云南大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)(2019043)。主要試劑: 依達(dá)拉奉、PBS購(gòu)自sigma；Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自同仁化學(xué)研究所；NeuN抗體購(gòu)自 Abcam公司，NLRP3(Bioss,1∶1000)、ASC(Bioss,1∶1000)、TXNIP(Abcam,1∶1000)、caspase-1(Bioss,1∶1000)、IL-18(Bioss,1∶1000)、IL-1β(Bioss,1∶1000)一抗抗體購(gòu)自KPL公司。電泳儀及電泳槽(E-C Apparatus Corporation，美國(guó))；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Western blot 轉(zhuǎn)膜儀、Cytation5 熒光成像系統(tǒng)和 Gel Doc 凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠離體皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng) 新生SD大鼠用75%酒精浸泡消毒皮膚后，迅速斷頭取腦。剝離出整個(gè)腦組織放入有10 mL解剖液(DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基+1%雙抗)的培養(yǎng)皿中，體式顯微鏡下找到腦膜，剝離腦膜，用顯微剪輕輕剪下大腦皮層組織，放入盛有解剖液的培養(yǎng)皿內(nèi)，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)。用顯微剪將取下來(lái)的大腦皮層組織在解剖液內(nèi)剪成約1 mm3大小，用巴氏吸管將組織塊連同解剖液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管內(nèi)，1000 rpm離心3 min，棄上清，0.25%胰酶消化10 min，巴氏吸管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后種植于細(xì)胞培養(yǎng)板中。每?jī)商鞊Q液一次。

1.2.2 培養(yǎng)神經(jīng)元的鑒定 分離培養(yǎng)原代神經(jīng)元接種至放有包被細(xì)胞爬片的24孔板中培養(yǎng)，5天后取出細(xì)胞，2%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，0.01 M PBS漂洗3次。加入5%羊血清室溫封閉60 min，加入按1∶200稀釋的NeuN一抗，4℃冰箱過(guò)夜。第二天取出細(xì)胞復(fù)溫至室溫，加0.01 M PBST漂洗4次，加熒光二抗于樣本上進(jìn)行標(biāo)記，37℃避光孵育1h后以0.01 M PBST漂洗3次。最后滴加50 μL的抗淬滅封片劑(含DAPI)封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.3 糖氧剝奪細(xì)胞模型的構(gòu)建 分離培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元并將培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元隨機(jī)分為4組，分別是：①大腦皮層神經(jīng)元正常培養(yǎng)。②大腦皮層神經(jīng)元+糖氧剝奪2 h+復(fù)糖氧12 h。③大腦皮層神經(jīng)元+500 μM依達(dá)拉奉。④大腦皮層神經(jīng)元+500 μM依達(dá)拉奉+糖氧剝奪2 h+復(fù)糖氧12 h。其中缺氧條件為3%O2、5%CO2，復(fù)氧條件為20.9%O2、5%CO2。

1.2.4 CCK-8檢測(cè) 原代分離神經(jīng)元，接種至96孔板內(nèi)，每孔接種5000個(gè)細(xì)胞，每組3孔重復(fù)，接種5 d后構(gòu)建糖氧剝奪細(xì)胞模型，另取3孔未接種細(xì)胞的空白孔加入100 μL無(wú)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白組。作用完后每孔加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度。細(xì)胞活力%=(實(shí)驗(yàn)孔OD-空白孔OD)/(正常細(xì)胞孔OD-空白孔OD)×100%。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)原代分離神經(jīng)元細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)，每孔接種105個(gè)細(xì)胞，每組3孔重復(fù)，接種5 d后構(gòu)建糖氧剝奪細(xì)胞模型。作用完后0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗3次，100 μL流式凋亡結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC染色液和5 μL PI染色液后混勻，室溫避光孵育15 min后用PBS將液面補(bǔ)至1 mL。用流式細(xì)胞儀分析計(jì)算神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA) 檢測(cè)神經(jīng)元ROS 取50 μL神經(jīng)元培養(yǎng)上清加入96空板中；除空白孔外，每孔加酶標(biāo)試劑100 μL，輕輕晃動(dòng)混勻，覆上板貼，37℃孵育1 h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，每孔加350 μL洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻， 37℃避光顯色15 min。依次每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，在反應(yīng)終止15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。使用ELISA calc軟件根據(jù)神經(jīng)元細(xì)胞濃度和OD值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，根據(jù)所得回歸方程即可算出樣本中ROS的含量。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè) ROS/TXNIP/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平將培養(yǎng)并進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)的細(xì)胞置于裂解液中裂解 30 min，冰上勻漿后 12000×g 離心10 min，獲取上清液，利用 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)蛋白的濃度。取 50 μg 蛋白，煮沸變性后上樣，依次進(jìn)行SDS-PAGE分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入稀釋的NLRP3(Bioss,1∶1000)、ASC(Bioss,1∶1000)、TXNIP(Abcam,1∶1000)、caspase-1(Bioss,1∶1000)、IL-18(Bioss,1∶1000)、IL-1β(Bioss,1∶1000)一抗抗體，4℃孵育過(guò)夜;以TBST清洗 5 min，清洗3次; 加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG (H+L) 二抗室溫孵育60 min;以TBST 清洗5 min，清洗3次; 避光ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。采用ImageJ 5.0軟件分析圖像灰度值。

2 結(jié)果

2.1 成功培養(yǎng)SD大鼠離體皮質(zhì)神經(jīng)元 神經(jīng)元培養(yǎng)后24 h開(kāi)始長(zhǎng)出小的突起，培養(yǎng)5天，突起較為明顯，具有明顯的神經(jīng)元形態(tài)(見(jiàn)圖1A)。經(jīng)免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的神經(jīng)元表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NeuN(見(jiàn)圖1B)，表明我們成功培養(yǎng)了SD大鼠離體皮質(zhì)神經(jīng)元。見(jiàn)圖1。

圖1 培養(yǎng)的SD大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元Figure 1 Cortical neurons of SD rat注：A.培養(yǎng)5天SD大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)；B.培養(yǎng)SD大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志物NeuN；C.DAPI染培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞核；D.B～C圖片疊加

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞活性的影響 按實(shí)驗(yàn)分組處理皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，并通過(guò)CCK-8檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性變化結(jié)果，與正常神經(jīng)元組相比，糖氧剝奪后神經(jīng)元細(xì)胞增殖活力顯著降低(P<0.001)，依達(dá)拉奉處理后明顯提高糖氧剝奪組神經(jīng)元活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 依達(dá)拉奉對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元活力及凋亡率的影響Figure 2 Cultured cortical neurons of SD rats注：A.糖氧剝奪前后依達(dá)拉奉處理對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元活力的影響；B.糖氧剝奪前后依達(dá)拉奉處理對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡率的影響。①P<0.01，②P<0.001

2.3 各組細(xì)胞凋亡率 正常神經(jīng)元組、糖氧剝奪組、依達(dá)拉奉處理組、糖氧剝奪+依達(dá)拉奉處理組細(xì)胞凋亡率分別為(0.877±0.112)%、(32.103±6.221)%、(1.537±0.631)%和(15.673±3.242)%。結(jié)果顯示在缺糖缺氧狀態(tài)下神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.001)，與糖氧剝奪組相比，經(jīng)依達(dá)拉奉處理后，神經(jīng)元的凋亡率明顯降低(P<0.001)，凋亡得到明顯改善。

2.4 依達(dá)拉奉對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞ROS水平的影響 按實(shí)驗(yàn)分組以ELISA試劑盒檢測(cè)神經(jīng)元培養(yǎng)上清ROS含量，結(jié)果表明糖氧剝奪后神經(jīng)元ROS水平顯著上升，依達(dá)拉奉處理后神經(jīng)元產(chǎn)生ROS含量又顯著下降(見(jiàn)圖3B)。表明依達(dá)拉奉能夠降低糖氧剝奪情況下皮質(zhì)神經(jīng)元ROS的產(chǎn)生。

2.5 依達(dá)拉奉對(duì)ROS/TXNIP/NLRP3信號(hào)通路的影響 培養(yǎng)神經(jīng)元以Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS/TXNIP/NLRP3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，神經(jīng)元缺氧后IL-1β蛋白(圖3C)、TXNIP蛋白(圖3D)、IL-18蛋白(圖3E)、Caspase-1蛋白(圖3F)、ASC蛋白(圖3G)和NLRP3蛋白(圖3H)表達(dá)水平均顯著上升，但在進(jìn)行依達(dá)拉奉處理后又顯著下降(P<0.01)。

圖3 依達(dá)拉奉對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元的影響Figure 3 Effects of edaravone on cortical neurons注：A.依達(dá)拉奉處理前后不同處理組皮質(zhì)神經(jīng)元免疫印跡實(shí)驗(yàn)；B.糖氧剝奪前后依達(dá)拉奉處理對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元ROS水平的影響；C.糖氧剝奪前后依達(dá)拉奉處理對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元IL-1β蛋白表達(dá)的影響；D.糖氧剝奪前后依達(dá)拉奉處理對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元TXNIP蛋白表達(dá)的影響；E.糖氧剝奪前后依達(dá)拉奉處理對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元IL-18蛋白表達(dá)的影響；F.糖氧剝奪前后依達(dá)拉奉處理對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元caspase-1蛋白表達(dá)的影響；G.糖氧剝奪前后依達(dá)拉奉處理對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元ASC蛋白表達(dá)的影響；H.糖氧剝奪前后依達(dá)拉奉處理對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元NLRP3蛋白表達(dá)的影響。①P<0.05，②P<0.01，③P<0.001

3 討論

多數(shù)臨床研究證實(shí)，氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)是介導(dǎo)缺血性腦損傷的兩大病理生理機(jī)制，抑制缺血后的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)可能是治療缺血性腦損傷的重要靶點(diǎn)[10]。已有研究表明，依達(dá)拉奉可以顯著減少梗死體積并緩解神經(jīng)功能缺損，并通過(guò)減少氧化應(yīng)激和炎癥發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[11-14]。本研究結(jié)果顯示，糖氧剝奪后神經(jīng)元活力顯著降低，凋亡率顯著上升，經(jīng)依達(dá)拉奉處理后，神經(jīng)元的凋亡情況得到明顯改善。說(shuō)明依達(dá)拉奉對(duì)神經(jīng)元糖氧剝奪損傷的具有神經(jīng)保護(hù)作用，與以往的研究結(jié)論一致。另外，目前研究認(rèn)為依達(dá)拉奉通過(guò)減少ROS、脂質(zhì)過(guò)氧化和VEGF水平誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖[15]，并且通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)發(fā)揮作用[16]。在本研究中，缺氧損傷后，神經(jīng)元氧化應(yīng)激水平顯著上升，依達(dá)拉奉處理后神經(jīng)元氧化應(yīng)激水平又顯著降低，也說(shuō)明了依達(dá)拉奉對(duì)神經(jīng)元氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制，與上述研究結(jié)果一致。

R0S/TXNIP/NLRP3 信號(hào)通路作為氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路之一，參與了多種疾病的發(fā)生發(fā)展[17-18]，但R0S/TXNIP/NLRP3 信號(hào)通路在腦缺血/再灌注性腦損傷中的研究較少。腦缺血時(shí)氧化呼吸鏈?zhǔn)軗p產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)可以通過(guò)硫氧還蛋白互動(dòng)性蛋白(TXNIP)相互之間解離并結(jié)合于Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)，進(jìn)而激活NLRP3[19]。NLRP3炎癥小體由NLRP3/ASC/Caspase-1/IL-1β、II-18構(gòu)成，NLRP3/ASC/Caspase-1級(jí)聯(lián)通路激活后，促進(jìn)IL-1β、IL-18的合成和釋放并造成腦組織發(fā)生炎癥損傷[20-21]，介導(dǎo)腦缺血神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和“焦亡”。本研究中采用依達(dá)拉奉后處理大鼠糖氧剝奪損神經(jīng)元，我們檢測(cè)了各組神經(jīng)元細(xì)胞中NLRP3、ACS、TXNIP、Caspase-1、IL-8和IL-1β蛋白的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示ROS含量及 TXN1P 、NLRP3 、 ASC和 caspase-1 蛋白水平顯著降低，且血清炎癥因子及腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)也顯著變化，因此我們認(rèn)為依達(dá)拉奉能夠降低大鼠糖氧剝奪損神經(jīng)元中R0S 的含量，抑制TNXIP/NLRP3 等炎性小體相關(guān)蛋白的聚集及激活，抑制下游氧化應(yīng)激指標(biāo)及炎癥因子的釋放，從而抑制組織細(xì)胞的凋亡，減輕腦組織損傷，提高腦缺血耐受，從而降低神經(jīng)元損傷。

4 小結(jié)

依達(dá)拉奉后處理能夠抑制ROS/TXNIP/NLRP3信號(hào)通路，有效減輕大鼠糖氧剝奪損神經(jīng)元損傷，這可能是依達(dá)拉奉發(fā)揮腦神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。也為臨床治療缺血性腦梗死提供了一定的參考。