莫婷 張海濤 李苑琪 余華軍 李國(guó)丹 魏婷 黃小琴 賈玉芳 涂名進(jìn) 嚴(yán)秀文

(1. 廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東 湛江 524023;2.廣東醫(yī)科大學(xué)生物多肽與蛋白質(zhì)研究應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023;3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室， 廣東 湛江 524023)

肺癌發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中居高不下[1]，其中超過(guò)80%的肺癌是非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC)。早期肺癌多無(wú)明顯癥狀，臨床上多數(shù)患者出現(xiàn)癥狀就診時(shí)已屬晚期，而晚期肺癌患者整體5年生存率約為17%左右[2]。因此，尋找肺癌新的分子標(biāo)記物以及潛在的治療靶點(diǎn)，為肺癌患者制定新的治療策略非常重要。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2 (Rho associated coiled coil forming protein kinase 2，ROCK2) 是Rho A小GTP蛋白激酶下游關(guān)鍵的重要效應(yīng)因子，屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，主要在腦、骨骼肌和心臟表達(dá)。ROCK2及其下游靶點(diǎn)參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，從而參與細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)[3]。此外，ROCK2還在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移以及血管生成等多種腫瘤進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。關(guān)于ROCK2在惡性腫瘤中的研究越來(lái)越多,它的異常表達(dá)被發(fā)現(xiàn)與許多癌癥包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有關(guān)[4-7]。但有關(guān)ROCK2在肺癌中致病機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道較少，而它可能作為肺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因子，對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的功能學(xué)研究有非常重要的意義。因此，本文通過(guò)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)人肺癌細(xì)胞系的ROCK2基因進(jìn)行敲除，構(gòu)建ROCK2基因敲除的A549、H460穩(wěn)定細(xì)胞株，為進(jìn)一步揭示ROCK2在肺癌細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)的功能以及在肺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中發(fā)揮的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460由本實(shí)驗(yàn)室保存提供，1640培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、100X青霉素-鏈霉素溶液及0.25%胰酶消化液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑與儀器 Lipo3000轉(zhuǎn)染試劑和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗購(gòu)于美國(guó)賽默飛公司；GAPDH和ROCK2一抗均購(gòu)于Cell Signaling Technology公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Realtime PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Takara Bio公司。PCR儀器: ABI 7500。

1.3 方法

1.3.1 載體構(gòu)建與表達(dá) Rock-2 CRISPR/Cas9 KO質(zhì)粒、Rock-2 HDR質(zhì)粒購(gòu)于Santa Cruz Biotechnology公司。根據(jù)CRISPR/Cas9的設(shè)計(jì)原則，3種不同的sgRNAs(sgRNA a、sgRNA b和sgRNA c)被設(shè)計(jì)用來(lái)構(gòu)建針對(duì)人類(lèi)的ROCK2基因,見(jiàn)表1。

表1 sgRNA寡核苷酸序列Table 1 sgRNA oligonucleotide sequences

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H460細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液的1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 將適量的A549細(xì)胞和H460細(xì)胞鋪進(jìn)含1 mL新鮮1640培養(yǎng)基的12孔板中。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%～70% 時(shí)，更換為不含血清1640培養(yǎng)基，根據(jù)賽默飛的Lipofectamine 3000 試劑實(shí)驗(yàn)方案每個(gè)孔分別添加0.5 μg Rock-2 CRISPR質(zhì)粒和0.5 μg Rock-2 HDR質(zhì)粒、1.5 μL的Lipo3000和2 μL P3000轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞和H460細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.3.4 穩(wěn)定細(xì)胞株的單克隆篩選 先確定用于殺死未轉(zhuǎn)染耐藥基因的細(xì)胞的嘌呤霉素的最低濃度。將適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)皿中，以確保第二天細(xì)胞密度達(dá)到80%或以上。細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天，更換含有不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基(0,0.4,0.6,0.8,1.2,1.6 μg/mL)，更換培養(yǎng)基后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。由于嘌呤霉素的效力非常強(qiáng)，不表達(dá)嘌呤霉素抗性基因的細(xì)胞可以在2～3天內(nèi)被殺死，因此可以通過(guò)顯微鏡觀察確定有效殺死正常細(xì)胞的藥物的最低濃度。A549細(xì)胞的篩選濃度為1.2 μg/mL，H460細(xì)胞的篩選濃度為2.0 μg/mL。穩(wěn)定細(xì)胞系的單克隆篩選。A549細(xì)胞和H460細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，分別加入含有1.2 μg/mL和2.0 μg/mL嘌呤霉素的10% FBS-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3天。3天后撤去含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，讓細(xì)胞長(zhǎng)到合適的細(xì)胞密度。用胰酶消化嘌呤霉素陽(yáng)性細(xì)胞，采用有限稀釋法將細(xì)胞懸液稀釋?zhuān)臃N到96孔板中，使得每個(gè)孔中最多1個(gè)細(xì)胞，再繼續(xù)培養(yǎng),最終可得到A549單克隆細(xì)胞株和H460單克隆細(xì)胞株。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株 將收集的細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解1 h 后離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按每組50 μg蛋白量上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：濃縮膠80V，30 min；分離膠：120V，1 h 10 min, 轉(zhuǎn)膜條件為11V, 2.5 h。裁膜后，采用5%脫脂奶粉封閉2 h后，按1∶500孵育ROCK2抗體( CST )、1∶1000孵育GAPDH抗體( CST )。4℃慢搖過(guò)夜，12 h回收一抗，1×TBST洗3遍,每次10 min。之后用HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(按1∶2000配置)室溫孵育1 h，回收二抗，1×TBST洗3遍,每次10 min。經(jīng)過(guò)曝光、X線(xiàn)膠片顯影成像、定影后，晾干膠片。

1.3.6 RNA提取及RT-qPCR檢測(cè) 用總RNA提取試劑盒從細(xì)胞中提取總RNA，用Real-Time PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物序列包括：ROCK2基因上游引物序列：5′-ATGAAACCAATG CTTTACTGCGAAC-3′，下游引物序列：5′-ACATCT GTGTCATTACCACGCTT-3′。內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGA T-3′，下游引物序列為：5′-GAAGGCTGGGGCTCAT TT-3′。所有基因的循環(huán)條件分別為：初始階段95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。一個(gè)周期熔融曲線(xiàn)階段95℃ 15 s，60℃ 1 min，最后95℃ 15 s。用內(nèi)源性管家基因GAPDH的mRNA表達(dá)水平歸一化處理后，使用2-ΔΔCt法計(jì)算ROCK2的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt =(實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值)-(對(duì)照組目的基因Ct值-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct值)。

1.3.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 A549組分為A549組和 A549 KO組。同樣設(shè)置H460組的實(shí)驗(yàn)分為H460組和H460 KO組。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞鋪至96孔板，每孔鋪1000個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。達(dá)到相應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間后，每孔加入100 μL含0.5 μg/mL MTT的培養(yǎng)基溶液, 每組細(xì)胞同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(只含有培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)。放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 h后在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD)值。

1.3.8 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 用胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)后每孔按100個(gè)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行鋪板，各挑選一株穩(wěn)定敲除細(xì)胞株(A549 KO、H460 KO)與未敲除原始細(xì)胞株(A549、H460)進(jìn)行對(duì)比，培養(yǎng)10～14天。肉眼可見(jiàn)細(xì)胞群落出現(xiàn)且在用顯微鏡觀察到大于50個(gè)細(xì)胞克隆數(shù)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1遍，加入甲醇固定30 min，PBS洗1遍。每孔加入1 mL氨基黑溶液染色15 min，吸出后用流水緩慢沖洗干凈染色液，干燥后拍照。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定敲除細(xì)胞株的ROCK2蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測(cè) 各選取3株純合子敲除細(xì)胞株進(jìn)行ROCK2蛋白表達(dá)驗(yàn)證，檢測(cè)CRISPR/Cas9技術(shù)的敲除效率。與A549、H460野生株相比較，ROCK2基因敲除株的ROCK2蛋白水平表達(dá)完全缺失，驗(yàn)證ROCK2基因敲除成功。結(jié)果表明成功構(gòu)建ROCK2基因敲除的單克隆A549、H460 細(xì)胞株，見(jiàn)圖1。

圖1 Western blot檢測(cè)ROCK2蛋白表達(dá)Figure 1 Western blot analysis the protein expression levels of ROCK2注：A.檢測(cè)ROCK2蛋白在A549與A549 KO細(xì)胞中的表達(dá); B.檢測(cè)ROCK2蛋白在H460與H460 KO細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定敲除細(xì)胞株的 ROCK2 mRNA表達(dá)水平 與A549和H460原始細(xì)胞株相比，ROCK2基因敲除細(xì)胞株的mRNA表達(dá)水平明顯降低，組內(nèi)的mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 RT-PCR 檢測(cè)穩(wěn)定敲除細(xì)胞株的mRNA表達(dá)水平Figure 2 RT-PCR detects the mRNA expression levels in stable knockout cell lines注：A.檢測(cè)A549 KO細(xì)胞株中 ROCK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量; B.檢測(cè)H460 KO細(xì)胞株中ROCK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。①P<0.05

2.3 MTT法檢測(cè)敲除細(xì)胞株細(xì)胞增殖能力ROCK2基因敲除細(xì)胞株與A549、H460原始細(xì)胞株相比，細(xì)胞活力顯著下降。說(shuō)明ROCK2基因敲除后抑制肺癌細(xì)胞的增殖，見(jiàn)圖3。

圖3 ROCK2敲除對(duì)肺癌細(xì)胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of ROCK2 knockout on the proliferation of lung cancer cells

2.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲除細(xì)胞株細(xì)胞集落形成能力 與A549、H460 原始細(xì)胞株相比較，ROCK2敲除細(xì)胞株的增殖能力均低于未敲除細(xì)胞,表明ROCK2在促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖方面有重要作用，見(jiàn)圖4。

圖4 ROCK2敲除對(duì)肺癌細(xì)胞集落形成能力的影響Figure 4 Effect of ROCK2 knockout on the colony formation ability of lung cancer cells

3 討論

ROCK2是Rho GTPases下游效應(yīng)蛋白研究比較多的靶標(biāo)之一[3]，也是Rho/ROCK信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子，通過(guò)調(diào)節(jié)靶蛋白的活性或磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[8]。許多研究表明ROCK2對(duì)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生的多種生物學(xué)進(jìn)程具有重要的作用，包括破壞細(xì)胞的粘附連接、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞簇的解離和增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性等[3,9-14]。ROCK2在癌癥中過(guò)度表達(dá)會(huì)引起腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)，影響腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[15]。有研究表明ROCK2在肺癌中高表達(dá)，它是NSCLC獨(dú)立生長(zhǎng)和侵襲所必需的，可能是治療NSCLC的一個(gè)靶點(diǎn)[16]。阻斷癌細(xì)胞的ROCK信號(hào)通路能有效地阻止細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成，從而減少腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。ROCK抑制劑的效果已在肺癌細(xì)胞中得到評(píng)估，如使用ROCK的抑制劑法舒地爾能抑制A549和95D肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[17-18]。馮飛躍等[19]用組織芯片聯(lián)合免疫組化技術(shù)檢測(cè)了135例NSCLC和105例配對(duì)癌旁肺組織中的ROCK2表達(dá)水平，結(jié)果顯示在NSCLC組織中的ROCK2表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁肺組織(P<0.001)?；颊唧w內(nèi)的ROCK2在NSCLC中的高表達(dá)往往提示預(yù)后不良，同時(shí)也是肺癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。這些證據(jù)表明ROCK2可能作為一種潛在的肺癌標(biāo)志物，參與肺癌的發(fā)生、發(fā)展。雖然目前有研究證實(shí)ROCK2在肺癌中的表達(dá)增加，但其調(diào)節(jié)肺癌生長(zhǎng)的機(jī)制研究較少，研究深入了解其在肺癌中的表達(dá)及其參與的細(xì)胞信號(hào)通路機(jī)制對(duì)于治療肺癌具有重要意義。

利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，可通過(guò)靶向腫瘤促進(jìn)基因、抑制劑治療相關(guān)基因、癌基因和化療耐藥相關(guān)基因?qū)崿F(xiàn)治療肺癌的目的。近年來(lái)，CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)以其特異性高、時(shí)間短、性?xún)r(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種有效可行的癌癥治療新方法，為肺癌治療提供了很大的潛力[20-22]。本研究的CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)由sgRNA(約20nt，與靶基因序列互補(bǔ))引導(dǎo)Cas9特異性切割目標(biāo)基因，造成DNA 雙鏈斷裂(DSBs)，在含有外源DNA修復(fù)供體即是有抗生素耐藥選擇標(biāo)記基因存在的情況下，細(xì)胞啟用高保真同源性修復(fù)(HDR)機(jī)制來(lái)對(duì)DSB進(jìn)行修復(fù)，會(huì)導(dǎo)致抗生素耐藥基因表達(dá)以及目標(biāo)基因提前終止表達(dá)，實(shí)現(xiàn)高效的基因定向突變[23-24]。另外，由多個(gè)外顯子組成的人類(lèi)基因在蛋白質(zhì)翻譯時(shí)可產(chǎn)生多個(gè)蛋白質(zhì)異構(gòu)體，所以設(shè)計(jì)3個(gè)不同的sgRNAs來(lái)針對(duì)ROCK2的基因編碼區(qū),可使基因敲除效率大幅提高。

本研究通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示在A549、H460ROCK2基因敲除細(xì)胞株的ROCK2 mRNA表達(dá)水平仍有殘留表達(dá)。分析原因發(fā)現(xiàn)，PCR的引物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)不在sgRNA敲除序列上，所以檢測(cè)仍可擴(kuò)出ROCK2 的mRNA序列。但是CRISPR/Cas9技術(shù)作用后插入了DNA片段，可能造成移碼突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)無(wú)法翻譯，且用免疫印跡法也檢測(cè)不到單克隆細(xì)胞中ROCK2蛋白質(zhì)的表達(dá)，說(shuō)明這兩株人肺癌ROCK2基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建成功。

本研究將Rock-2 CRISPR/Cas9 KO質(zhì)粒和Rock-2 HDR 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞和H460細(xì)胞，嘌呤霉素篩選出陽(yáng)性細(xì)胞并稀釋至單個(gè)細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。免疫印跡法檢測(cè)單克隆細(xì)胞中ROCK2蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果也證明了細(xì)胞株中蛋白R(shí)OCK2的表達(dá)完全缺失。RT-qPCR檢測(cè)基因編輯后的mRNA基因產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)ROCK2 mRNA水平的顯著下降(P<0.05)。敲除ROCK2基因后, 克隆形成平板實(shí)驗(yàn)以及MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均能說(shuō)明A549、H460 細(xì)胞增殖能力明顯下降,提示ROCK2正調(diào)控肺癌細(xì)胞的增殖。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與研究報(bào)道的ROCK2作為促進(jìn)細(xì)胞增殖的調(diào)控分子相吻合。

4 結(jié)論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為近年來(lái)被大量使用的基因編輯技術(shù)，是研究基因功能的強(qiáng)有力工具。獲得穩(wěn)定敲除ROCK2基因的肺癌細(xì)胞株為后續(xù)研究ROCK2在肺癌細(xì)胞中的功能奠定了基礎(chǔ)。