魏亞情，吳志祥，楊 川，蘭國玉

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所，海南 ?？?570216；2.海南儋州熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站，海南 儋州 571737；3.海南大學(xué) 生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，海南 海口 570228）

海南島是中國緯度最低、面積最大的熱帶地區(qū)[1]。海南橡膠林的分布幾乎占到海南島植被總面積的四分之一[2]。由此可見，熱帶橡膠林也已成為中國熱帶地區(qū)，特別是海南地區(qū)最重要的生態(tài)系統(tǒng)[3]，微生物是地球上數(shù)量最多、物種極為豐富的生物類群，是生物區(qū)系的重要組成部分，參與碳、氮、磷等重要元素的生物地球化學(xué)循環(huán)，并在促進營養(yǎng)的循環(huán)、降解各種污染中發(fā)揮著無可替代的作用[4]。與地上植物相比，土壤微生物空間格局與過程，人們了解較少[5]，因此土壤微生物群落構(gòu)建與多樣性格局是生態(tài)學(xué)中面臨的巨大挑戰(zhàn)。關(guān)于海南熱帶森林土壤微生物群落分布格局方面的研究較少[6-10]。

微生物的地理分布格局和生態(tài)驅(qū)動因素已有較多的研究[8,11-17]，土壤理化性質(zhì)在空間尺度上的異質(zhì)性，是土壤微生物群落組裝和多樣性的主要驅(qū)動因素[18-20]。然而，對土壤微生物在時間尺度上的變化則研究較少。Chen 等[21]研究表明，汀江微型真核浮游生物群落具有顯著的干濕季差異，Zhang 等[22]對華北平原麥田冬季和夏季土壤微生物的研究中，土壤微生物群落表現(xiàn)出顯著的季節(jié)差異，但空間距離對群落多樣性的影響顯著大于季節(jié)。Vo?í?ková 等[23]研究表明，橡樹林土壤真菌隨四季的更替，真菌類群的活性、生物量含量、組成和相對豐度都有明顯的季節(jié)性變化。盡管已有關(guān)于土壤微生物時間變化的研究，但大都集中于不同采樣月份或年際變化[24-28]。

海南島具有明顯的旱雨季變化，其獨特的氣候條件對土壤細菌群落的影響如何？目前對此方面的研究還尚有欠缺。因此海南島橡膠林土壤細菌群落對旱季雨季變化的響應(yīng)及其驅(qū)動因素是本研究重點要解決的科學(xué)問題。為探究以上問題，本實驗共采集了130 份海南旱季和雨季的橡膠林土壤樣本，采用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)手段對海南橡膠林旱季和雨季的土壤細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)進行了分析，試圖闡明海南島橡膠林土壤細菌群落多樣性的季節(jié)變化及其影響因子，研究結(jié)果為進一步深入分析橡膠林微生物群落、生態(tài)功能及天然橡膠產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣地

海南島面積為3.4萬km2，屬于海洋性熱帶季風(fēng)氣候，全年溫暖濕潤，年均溫度為22～26℃之間；海南雨量充沛，年降水量在1 000～2 600 mm之間，年平均降水量為1 639 mm，有明顯的多雨季和少雨季。每年的5—10月份是多雨季，總降水量達1 500 mm 左右，占全年總降水量的70%～90%；每年11月至翌年4月為少雨季節(jié)，僅占全年降水量的10%～30%。橡膠林主要分布在中部山區(qū)四周的臺地及交通便利，靠近水源地的區(qū)域。共選擇了5 個樣地，分別位于海南儋州、瓊中、萬寧、樂東和?？?。

1.2 樣本采集

每個樣地中隨機設(shè)置13 個重復(fù)取樣點，旱季和雨季各采樣一次，每個點采樣2 次，分別在2018年1月和7月進行取樣，共采集了130 份土壤樣本。取樣步驟：取樣時除去地面植被和枯枝落葉，鏟除表面1 cm 左右的表土，以避免地面微生物與土樣混雜。用直徑為4.5 cm 的取土鉆進行采樣取土層0～20 cm，混合均勻后過2 mm 篩子后，并按照要求將土樣分為3 份，前2 份帶回實驗室風(fēng)干處理或鮮樣分析，第3份用于高通量分析。用于高通量分析的土樣放入液氮罐中，帶回實驗室放入-80℃的冰箱中保存以待分析。

1.3 DNA 抽提和PCR 擴增

土壤樣本由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。細菌采用515FmodF 引物進行PCR 擴增，引物序列為：5′-GTGYCAGCMG CCGCGGTAA-3′[29-30]，擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，27 個循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），最后72℃延伸10 min，擴增體系為20 μL，4 μL5×FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5 mmoldNTPs，0.8 μL 引物(5 μmol)，0.4 μLFastPfu聚合酶，10 ngDNA 模板使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物。

1.4 Illumina Miseq 測序

利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(AxygenBiosciences，Union City，CA，USA) 進行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor ?-ST(Promega，USA)進行定量。根 據(jù)Illumina MiSeq 平 臺(Illumina，SanDiego，USA)標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE(2×250)的文庫。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用FLASH 軟件對原始數(shù)據(jù)序列進行篩選優(yōu)化，對優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，按照97%相似性對非重復(fù)序列(不含單序列）進行OTU 聚類，得到相似性在97%以上的有效序列[31]。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 數(shù)據(jù)庫(SSU128)，設(shè)置比對閾值為70%[32]，利用mothur 計算不同隨機抽樣下的α 多樣性指數(shù)[32]?；贐ray-Curtis 距離，進行主坐標分析（PCoA），揭示了兩個季節(jié)細菌群落結(jié)構(gòu)相似性，用相似性分析（ANOSIM）分析季節(jié)對橡膠林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的季節(jié)差異，通過置換多因素方差分析（PERMANOVA）分析不同分組對樣品差異的解釋度，線性回歸分析細菌多樣性和環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系，采用RDA 分析來揭示細菌群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性，計算在R 的‘Vegan’包中進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤細菌群落組成

通過對海南島橡膠林不同季節(jié)的樣本進行高通量測序，共檢測到細菌41 門、108 綱、247 目、465 科、876 屬。細菌群落中，優(yōu)勢菌門依次為變形菌門(Proteobacteria)(33.28%)、酸桿菌門(Acidobacteria)(19.27%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(13.63%)、放線菌門(Actinobacteria)(12.41%)（圖1a）。優(yōu)勢綱依次為α- 變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)(21.20%)、酸桿菌綱(Acidobacteria)(19.27%)、放線菌綱(Actinobacteria)(12.41%)、浮霉菌綱(Planctomycetacia)(7.70%)、纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)(5.78%)、δ 變形菌變形菌綱(Deltaproteobacteria)(4.96%)(圖1b)。

旱季和雨季的優(yōu)勢類群相同，但相對豐度比例有差異，在菌門水平上，旱季優(yōu)勢菌門相對豐度依次是變形菌門(31.87%)、酸桿菌門(20.71%)、綠彎菌門(14.05%)、放線菌門(11.53%)，雨季優(yōu)勢菌門相對豐度依次是變形菌門(34.50%)、酸桿菌門(18.03%)、綠彎菌門(13.26%)、放線菌門(13.17%)（圖1c）。在綱水平上，旱季優(yōu)勢菌綱相對豐度依次是α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)(20.85%)、酸桿菌綱(Acidobacteria)(20.71%)、放線菌綱(Actinobacteria)(11.53%)、浮霉菌綱(Planctomycetacia)(8.34%)、纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)(6.53%)、δ 變形菌變形菌綱(Deltaproteobacteria)(4.44%)，雨季優(yōu)勢菌綱相對豐度依次是α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)(21.37%)、酸桿菌綱(Acidobacteria)(18.03%)、放線菌綱(Actinobacteria)(13.17%)、浮霉菌綱(Planctomycetacia)(7.15%)、δ 變形菌變形菌綱(Deltaproteobacteria)(5.42%)、纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)(5.12%)(圖1d)。

圖1 橡膠林土壤細菌不同分類水平中的群落組成Fig.1 Composition of soil bacteria in rubber plantations at different classification levels

用PCoA(主坐標分析、基于Bray-Curtis 距離)排序分析方法對群落組成進行可視化（圖2），相似性分析(ANOSIM)結(jié)果表明，旱季和雨季土壤樣本間群落組成差異顯著(R=0.054，P=0.001)。通過置換多因素方差分析(PERMANOVA)分析不同分組對樣品差異的解釋度，結(jié)果表明，季節(jié)變化僅能解釋細菌群落組成差異的2.48%(R2=0.024 8，P=0.001)。

圖2 基于Bray-Curtis 距離的不同季節(jié)橡膠林土壤細菌主坐標分析Fig.2 PcoA analysis of bacterial communities of rubber plantations in different seasons,based on Bray-Curtis distance

2.2 土壤細菌群落多樣性

α 多樣性分析反映微生物群落的豐富度和多樣性，從Sobs、ACE 指數(shù)、Chao 1 指數(shù)和Shannon指數(shù)、Simpson 指數(shù)分析來看，雨季橡膠林土壤細菌Sobs、ACE 指數(shù)和Chao 1 指數(shù)顯著高于旱季(P＜0.05)，而Shannon 指數(shù)高于旱季，Simpson指數(shù)低于旱季，但差異都不顯著(表1)。

表1 不同季節(jié)橡膠林土壤細菌多樣性指數(shù)?Table 1 Diversity index of soil fungi in rubber plantations in different seasons

2.3 土壤群落多樣性與生態(tài)因子的相關(guān)性

通過線性回歸分析可知(圖3)，細菌α 多樣性與pH 值、全鉀(TK)、有效鉀(AK)、溫度(Tem)、有效磷(AP)顯著正相關(guān)(pH：R2=0.43，P＜0.001；TK：R2=0.27，P＜0.001；AK：R2=0.26，P＜0.001；Tem：R2=0.26，P＜0.001；AP：R2=0.05，P=0.01)，與土壤含水量(WC)、有機質(zhì)(SOM)、硝態(tài)氮(NN)、全磷(TP)、降雨(Pre)顯著負相關(guān)(WC：R2=0.16，P＜0.001；SOM：R2=0.03，P=0.04；NN：R2=0.05，P=0.009；TP：R2=0.06，P=0.003；Pre：R2=0.20，P＜0.001)。在所有的環(huán)境因子中，pH 值是影響土壤細菌多樣性的最重要環(huán)境因子。

圖3 細菌多樣性與環(huán)境因子線性相關(guān)分析Fig.3 Analysis of linear correlation between bacterial diversity and environmental factors

RDA 分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子中土壤含水量(WC)、有機質(zhì)(SOM)、pH 值、有效鉀(AK)、全氮(TN)、全磷(TP)、全鉀(TK)是細菌群落β 多樣性的主要影響因子（圖4），分別解釋了細菌群落組成的7.94%、8.79%、6.13%、6.52%、5.42%、7.79%(表2)。其中，有機質(zhì)(SOM)對群落組成的解釋度最大。

表2 環(huán)境因子對微生物群落的解釋度Table 2 Percentage of variation in bacterial communities explained by environmental factors,based on RDA results

圖4 橡膠林土壤細菌RDA 分析Fig.4 Redundancy analysis of the soil bacterial communities in rubber plantations

3 結(jié)論與討論

本研究采用高通量測序方法對橡膠林土壤細菌群落組成和多樣性進行了研究，結(jié)果表明，本研究中的細菌優(yōu)勢類群與全球采樣尺度上細菌群落的優(yōu)勢菌門一致[33]。此外，我們還發(fā)現(xiàn)幾種優(yōu)勢菌門在旱雨季的分布情況不同，例如，酸桿菌們和綠彎菌門的相對豐度表現(xiàn)出旱季高于雨季，而變形菌門和放線菌們的相對豐度表現(xiàn)出雨季高于旱季。

本研究還發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子中pH 值和SOM 分別是α 多樣性和β 多樣性最主要的影響因子。前人研究報道，pH 值是解釋細菌群落多樣性和組成的主要環(huán)境變量[34-36]，本研究中細菌群落多樣性與土壤環(huán)境因素有顯著的相關(guān)性，研究結(jié)果證實了在人工林生態(tài)系統(tǒng)中pH 值也是細菌多樣性最主要的驅(qū)動因子[20,37]。土壤理化性質(zhì)是土壤微生物群落的多樣性重要驅(qū)動因子[11,18]，RDA 分析結(jié)果表明，環(huán)境因子中SOM 也是影響細菌群落結(jié)構(gòu)的最主要因素，解釋了細菌群落結(jié)構(gòu)總方差的8.79%。

橡膠林土壤細菌群落多樣性存在顯著的旱雨季差異。有研究表明采樣時間對微生物的群落組成影響較小[14,20,26]，而Habekost、Lan 和Vo?í?ková等的結(jié)果表明，土壤微生物的群落組成存在明顯的季節(jié)變化[23-24,38]。本研究結(jié)果與后者研究一致，橡膠林土壤細菌群落呈現(xiàn)出顯著的季節(jié)差異，值得注意的是，季節(jié)變化只能解釋其總方差的2.48%，可能是因為本研究中存在其他尚未測量的環(huán)境因素的影響[39-40]，如微生物間互作（競爭，捕食）[41-42]和生態(tài)進程等（休眠，持久性特征等）[43]。