周紅敏，彭 輝，徐肇友，駱先有，陳杏林，陳煥偉

（1.龍泉市林業(yè)科學研究院，浙江 龍泉 323700；2.鳳陽山管理處，浙江 龍泉 323700）

土壤真菌是土壤微生物的重要組分之一，在有機質(zhì)分解，物質(zhì)循環(huán)等方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。真菌對土壤環(huán)境的變化較細菌更為靈敏[3-4]，其群落結(jié)構(gòu)變化被當作生態(tài)系統(tǒng)恢復的重要指標[5]。真菌群落結(jié)構(gòu)變化跟土地利用方式[6]、管理措施[7-8]、pH 值[9]等有關(guān)。杉木Cunninghamia lanceolata是我國南方重要的經(jīng)濟樹種[10-11]。相關(guān)研究表明上連栽會使土壤肥力下降[12]，碳、氮循環(huán)菌減少等[13]。油茶Camellia oleifera是世界四大木本油料樹種之一，是我國特有的食用木本油料作物[14-17]。在我國南方丘陵地區(qū)油茶林多是在杉木采伐跡地墾造完成，受油茶林管理及枯落物分解等影響，林地土壤環(huán)境等因子勢必發(fā)生變化。目前，已有很多學者開展了，不同林齡油茶林化學計量特性[18-19]、土壤理化性質(zhì)[20]等變化規(guī)律的研究，例如費裕翀[21]等研究了不同施肥處理對油茶林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。但對于杉木林改為油茶林后土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性變化尚未見報道。因此，通過Illumina Miseq 測序技術(shù)，研究杉木林轉(zhuǎn)變?yōu)橛筒枇趾笸寥勒婢淖兓闆r，以期為油茶林的培育供科學依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省龍泉市上圩林區(qū)（27°59′05″～27°59′15″N，119°03′32″～19°04′17″E），屬于中亞熱帶季風氣候，年均降水量為1 650 mm 左右，年平均相對濕度79%。極端最高氣溫為41.5℃，極端最低氣溫為-8.5℃。油茶為2010年在杉木采伐跡地造林，胸徑11.7 cm，樹高3 m。油茶林每年撫育2 次，施復合肥1 125 kg/hm2。杉木林為1986年造林，胸徑、樹高分別為22.3 cm、17 m，近10年來杉木林除2019年施過復合肥750 kg/hm2以及深耕除草一次外，未進行任何人工管理。

2 研究方法

2.1 土壤樣品采集

選取立地條件相近的杉木林和油茶林，于2020年10月在各林分中分別設置20 m×20 m 的3 塊標準樣地，采用5 點取樣法采集0～20 cm 的表層土壤，將每一樣地5 個取樣點的土樣混勻，挑出石礫、根系等雜質(zhì)，其中一份裝入無菌自封袋中于冷藏箱帶回，置于-80℃冰箱中保存，用于土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性測定；另一份風干后過2 mm 篩用于土壤化學性質(zhì)分析，土壤理化性質(zhì)參照魯如坤[22]的分析方法進行。

2.2 土壤DNA 提取和高通量測序

取0.5 g 土壤樣品用于土壤總DNA 抽提（E.Z.N.A.? Soil DNA Kit 試劑盒），抽提后的DNA 利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA 的純度和濃度采用NanoDrop2000進行檢測；引物為SSU0817F（5′-TTAGCATGGA ATAATRRAATAGGA-3′） 和1196R（5′-TCTGGA CCTGGTGAGTTTCC-3′），擴增區(qū)域為V5-V7 區(qū)。用2%的瓊脂糖凝膠對同一樣本混合后PCR 產(chǎn)物進行電泳檢測，PCR 產(chǎn)物回收采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒，然后洗脫（Tris_HCl）、電泳檢測（瓊脂糖2%）。用Promega 公司的QuantiFluor ?-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)對PCR 產(chǎn)物進行檢測定量。通過Illumina 公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

2.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)用fastp（0.19.6）軟件[23]進行數(shù)據(jù)質(zhì)控，采用Mothur（1.30.2）軟件進行Alpha 多樣性分析（Simpson 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Coverage 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)），Qiime（1.9.1）分析真菌各分類學分度，統(tǒng)計真菌在門、綱、屬水平上的群落組成進行分析。以冗余分析（Redundancy analysis，RDA）分析土壤理化性質(zhì)和優(yōu)勢真菌群落相關(guān)性。采用SPSS19.0 軟件進行單因素分析和LSD 顯著性檢驗，Excel 2016 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤理化性質(zhì)

由表1可知，杉木林的土壤含水率、全氮、全磷、堿解氮和有機質(zhì)的含量分別為24.63%、1.02 g/kg、0.26 g/kg、61.28 mg/kg 和38.19 g/kg，均顯著高于油茶林（P＜0.05）。杉木林土壤中全鉀和pH 和油茶林相比差異不顯著（P＞0.05）。油茶林土壤有效磷和速效鉀分別是杉木林的1.88倍和1.34 倍，顯著高于杉木林（P＜0.05）。

表1 2 種植被類型土壤理化性質(zhì)?Table 1 Soil physicochemical properties of the 2 plantations

3.2 土壤真菌α 群落多樣性

6 個土樣中有效系列為309 733 條，有效堿基數(shù)為118 113 323 bp，序列平均長度為381 bp，2種林地的Coverage 指數(shù)均為99.98%，表明測序結(jié)果全面地反映真菌群落在所測土壤樣本中的存在狀況。2 種林地土壤真菌多樣性結(jié)果見表2。杉木林的Shannon 指數(shù)（3.02）、Ace 指數(shù)（170.31）均高于油茶林，說明杉木林土壤中真菌多樣性和豐度較高，但是均不存在顯著差異（P＞0.05）。杉木林的Simpson 指數(shù)（0.106 6）低于油茶林，差異不顯著（P＞0.05），杉木林的Chao1 指數(shù)（173.12）顯著高于油茶林。2 種植被類型土壤真菌群落的Ace 指數(shù)和Chao1 指數(shù)均較低，說明2種植被類型中真菌數(shù)量較低。

表2 2 種植被類型土壤真菌多樣性指數(shù)Table 2 Diversity indices of soil fungal communities in the 2 plantations

3.3 真菌群落組成分析

2 種植被類型的土樣中共檢測出真菌門18個，真菌綱46 個，真菌目74 個，真菌科92 個，真菌屬98 個，真菌種116 個，OTU252 個。杉木林和油茶林土壤中相對豐度在1%以上的優(yōu)勢菌門有3 個（圖1a），分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和毛霉菌門（Mucoromycota）。杉木林土壤中子囊菌門相對豐度（67.19%）低于油茶林（76.53%），杉木林擔子菌門（24.38%）高于油茶林（15.45%），杉木林和油茶林毛霉菌門的相對豐度分別為4.38%和4.94%，3 個優(yōu)勢菌門在2 種植被類型間均不存在顯著差異（P＞0.05）。

如圖1b 所示，2 種植被類型的土壤真菌群落在真菌綱水平上的組成不同。杉木林土壤中相對豐度在1%以上的且鑒定出的優(yōu)勢菌綱有8 個，古根菌綱（Archaeorhizomycetes）的相對豐度最大（28.53%），其次為傘菌綱（Agaricomycetes）（15.13%）、散囊菌綱（Eurotiomycetes）（14.79%）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）（9.61%）、銀耳綱（Tremellomycetes）（6.75%）、盤菌綱（Pezizomycetes）（4.5%）、錘舌菌綱（Leotiomycetes）（3.72%）、座囊菌綱（Glomeromycetes）（1.85%）。油茶林土壤中鑒定出的相對豐度在1%以上的優(yōu)勢菌綱有7個，相對豐度最大的是散囊菌綱（23.41%），其次為糞殼菌綱（22.52%），古根菌綱（20.4%）、傘菌綱（13.96%）、錘舌菌綱（4.21%）、球囊菌綱（2.91%）、銀耳綱（1.35%）。油茶林中散囊菌綱顯著高于杉木林（P＜0.05），其余優(yōu)勢菌綱在2 種植被類型間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1c 所示杉木林和油茶林土壤真菌在屬水平上識別出且相對豐度1%以上的屬共有9 個，其中7 個屬于子囊菌門，分別為Archaeorhizomyces（28.54%、20.4%）、籃狀菌屬(Talaromces)（11.76%、21.36%）、木霉菌屬（Trichoderma）（4.21%、8.11%）、毛殼菌屬（Chaetomium）（1.6%、6.18%）、Meliniomyces（2.6%、1.98%）、稻瘟病菌（Magnaporthe）（0.29%，3.08%）和瓶霉屬（Phialophora）（0.45%，1.17%）。而粗糙孔菌屬（Trechispora）（0.34%，1.96%）和紅菇屬（Russula）（1.48%,0.04%）則屬于擔子菌門。油茶林土壤中毛殼菌屬和稻瘟病菌顯著高于杉木林（P＜0.05），Archaeorhizomyces、籃狀菌屬、木霉菌屬、Meliniomyces粗糙孔菌屬、瓶霉屬和紅菇屬在2 種植被類型土壤中差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 真菌門、綱和屬水平上的相對豐度Fig.1 The relative abundances of dominant fungi at the phylum,class and genus levels

3.4 環(huán)境因子對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤真菌與土壤理化性質(zhì)的冗余分析如圖2所示。由圖2可知，第一排序軸和第二排序軸的RDA 相關(guān)分析可知，第一排序軸的解釋率為82.89%，第二排序軸的解釋率為14.02%，，兩個排序軸的解釋率為96.91%，說明土壤理化性質(zhì)對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有較大影響。全磷和速效鉀對第一排序軸貢獻較大，速效鉀對第二排序軸的貢獻最大，其次為全磷，綜合來看，全磷對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響最大，其次為堿解氮。

圖2 土壤真菌與土壤理化性質(zhì)的冗余分析Fig.2 Redundancy analysis（RDA）of the relationships between soil physicochemical properties and fungal communities of A B treatments

優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌綱對土壤理化性質(zhì)的響應表3。擔子菌門與全磷顯著正相關(guān)（P＜0.05）。糞殼菌綱與堿解氮極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與有效磷顯著正相關(guān)（P＜0.05）。銀耳綱與全磷和堿解氮極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與全氮顯著正相關(guān)（P＜0.05）。錘舌菌綱與全鉀顯著負相關(guān)（P＜0.05），unclassified_p_Ascomycota 與全鉀極顯著負相關(guān)（P＜0.01）。座囊菌綱與堿解氮和有機質(zhì)顯著負相關(guān)（P＜0.05）。

表3 土壤真菌優(yōu)勢門（門、綱水平）相對豐度和土壤理化性質(zhì)相關(guān)關(guān)系?Table 3 Correlation between soil physicochemical properties and dominant fungal phyla and classes

4 討 論

4.1 2 種植被類型對真菌優(yōu)勢門、綱和屬類群的影響

研究結(jié)果表明，杉木林和油茶林的土壤中優(yōu)勢菌門、優(yōu)勢菌綱和優(yōu)勢菌屬的組成存在一定的相似，但優(yōu)勢菌門、優(yōu)勢菌綱和優(yōu)勢菌屬在2 種植被類型土壤中的相對豐度又有一些差異，這是因為不同植物根系的分泌物和枯落物對菌群多樣性和結(jié)構(gòu)有影響[24-26]。杉木林和油茶林土壤中主要優(yōu)勢菌門為子囊菌門和擔子菌門，兩個菌門在土壤中的豐度之和為91.57%～91.97%。結(jié)果與陳秀波[27]、曹紅雨[28]、楊立賓[29]等研究結(jié)果相似。子囊菌門和擔子菌門屬于高等陸生真菌，在透氣性好的酸性土壤中更容易生長。子囊菌門以腐生營養(yǎng)型菌居多，可以將林分中較難降解的角質(zhì)素等進行分解，對森林生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)具有重要作用[30-31]。油茶林土壤中的子囊菌門高于杉木林，有利于油茶林枯落物的分解，擔子菌門對木纖維素的降解、植物菌根的形成等具有促進作用[32]，還可以降低病原菌對植物的危害[33-34]。油茶林土壤中擔子菌門的相對豐度比杉木林顯著下降，說明油茶林發(fā)生真菌病害的概率有所增加。在真菌綱水平上，2 種植被類型的群落組成不同，杉木林土壤已鑒定出的優(yōu)勢菌綱的排序為古根菌綱＞傘菌綱＞散囊菌綱＞糞殼菌綱＞銀耳綱＞盤菌綱＞錘舌菌綱＞座囊菌綱。油茶林的排序為散囊菌綱＞糞殼菌綱＞古根菌綱＞傘菌綱＞錘舌菌綱＞球囊菌綱＞銀耳綱。2 種植被類型土壤中識別的優(yōu)勢菌屬為Archaeorhizomyces、籃狀菌屬、木霉菌屬、毛殼菌屬、Meliniomyces、稻瘟病菌、粗糙孔菌屬、瓶霉屬和紅菇屬。與前人研究中青霉屬為主要優(yōu)勢菌屬略有不同[35]，本研究的主要優(yōu)勢菌屬為Archaeorhizomyces和籃狀菌屬，相對豐度之和為40.3%～41.76%，這可能由于林地類型，樹種[36-37]、土壤理化性質(zhì)[38]等不同引起土壤群落結(jié)構(gòu)的變化[39]。

4.2 土壤理化性質(zhì)對土壤真菌群落及多樣性的影響

通過對2 種植被類型土壤真菌的a 多樣性分析，杉木林的真菌多樣性和豐度均高于油茶林。在綱水平上，真菌群落組成不同，說明杉木林轉(zhuǎn)為油茶林改變了土壤真菌群落結(jié)構(gòu)。土壤的含水率、pH 等因素可單獨或相互作用于土壤真菌群落結(jié)構(gòu)[40]。由冗余分析可知，全磷和堿解氮是影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素。Lauber 等[41]研究表明子囊菌門與土壤中的氮含量呈顯著正相關(guān)，本研究中子囊菌門與全氮呈負相關(guān)，但不顯著。全磷對擔子菌門呈顯著正相關(guān)。堿解氮與3 個菌綱成顯著相關(guān)（糞殼菌綱、銀耳綱、座囊菌綱）。有效磷與2個菌綱呈顯著相關(guān)（糞殼菌綱、銀耳綱）。銀耳綱與全氮和全磷呈顯著正相關(guān)，錘舌菌綱與全鉀呈顯著負相關(guān)。結(jié)果說明不同的理化因子對特定的菌綱有顯著作用，而土壤中環(huán)境因子的改變對真菌門、綱等相對豐度影響較大，進而改變土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)組成。

5 結(jié) 論

1）杉木林的真菌多樣性高于油茶林，但差異不顯著。杉木林的真菌豐度顯著高于油茶林。全磷和堿解氮是影響真菌群落的主要因子。

2）2 種植被類型土壤中共檢測出真菌門18個，真菌綱46 個，真菌目74 個，真菌科92 個，真菌屬98 個，真菌種116 個，OTU252 個。杉木林轉(zhuǎn)為油茶林后，子囊菌門和擔子菌門是占絕對優(yōu)勢的2 個菌門，擔子菌門相對豐度杉木林顯著高于油茶。杉木林的優(yōu)勢菌綱古根菌綱、傘菌綱和散囊菌綱。油茶林的優(yōu)勢菌綱為散囊菌綱、糞殼菌綱、古根菌綱。2 種植被土壤中的優(yōu)勢菌屬為Archaeorhizomyces和籃狀菌屬。本研究杉木林轉(zhuǎn)為油茶林后真菌群落結(jié)構(gòu)組成相似，但只研究了杉木轉(zhuǎn)為油茶林后真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，隨著油茶林種植年限的增加，接下來的研究中還需進一步研究成熟油茶林真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，以期為油茶林的精細化管理提供更多可以參考的依據(jù)。